생화학 실험 (2) 5주차 Subcloning Ⅱ : Detection of Subcloning - Rapid Microscale Isolation of Plasmid from Transformed Cells 담당교수 : 하상준 교수님 담당조교 : 조소영

Introduction 1. Small-Scale preparation of Plasmid DNA by Alkali : Transformation 된 cell을 키운 후 Alkali를 이용하여 cell 을 깨고 protein 을 변성 시키는 방법으로 plasmid DNA 를 대장균에서 분리하여 subcloning 여부를 확인 2. Small-Scale preparation of Plasmid DNA by Boiling : Alkaline lysis 방법은 NaOH/SDS에 의해 cell membrane의 phospholipid 와 protein component를 solublize 시켜서 DNA 를 얻어내는 방법인데 반해 cell wall을 약하게 만든 후 boiling으로 lysis 시켜 DNA를 얻어내는 방법 Boiling 에 의한 방법은 Alkaline lysis 방법에 비해 더 쉽고 간단하고 빠르게 뽑힌다는 장점이고 Sequence analysis 나 restriction digest 에도 적합 하지만 boiling 에 의한 방법은 그 yield가 높음에도 불구하고 chromosomal DNA, RNA, protein 등에 의해 contamination 되는 경우가 많다

Procedure 1. Small-Scale preparation of Plasmid DNA by Alkali 1) Harvest 1. Prep 하기 하루 전에 transformation 했던 cell 중에서 colony만 LB- Amp 배지 2 ml 에 접종하여 37℃ shaking incubator에서 overnight으 로 배양한다. 2) Lysis by Alkali 1. Pellet dispersing (Sol’n 1) 2. Cell lysis (Sol’n 2) 3. Neutralization (Sol’n 3) 4. Centrifugation (14,000 X g, 5min) 5. Supernatant collecting ( + P/C/I ), vortexing, centrifugation 6. Supernatant collecting ( + 100% EtOH), inverting, standing 7. Centrifugation (14,000 X g, 5min) 8. supernatant discarded ( + 70% EtOH), mix, centrifugation, dry 9. Dissolving in TE (containing DNase-free RNase A)

Procedure 1. Cell down : 3ml에 해당하는 media를 EP tube에 담고 centrifuge 1min, 13,000rpm. 2. Cell pellet: 상층 액은 제거하고 pellet만 남김 3. Cell Resuspension: pellet이 있는 EP tube에 250ul buffer P1 첨가, vortexing 4. Cell lysis: 250ul buffer P2 첨가, inverting (4~5번, 부드럽게) 5. Cell Neutralization: 350ul buffer N3첨가, inverting (4~5번, 부드럽게) 6. Centrifuge 15min, 13,000rpm : spin column 준비 7. Plasmid가 포함된 상층액만 조심스럽게 pipette으로 spin column으로 옮 긴다. 8. Centrifuge 30sec, 13,000rpm, flow-through 제거 9. Washing step: spin column에 500ul buffer PB첨가 10. centrifuge 30sec, 13,000min, flow-through 제거 11. Washing step: 750ul buffer PE 첨가, 12. Centrifuge 30sec, 13,000rpm, flow-through 제거 13. : Centrifuge 1min, 13,000rpm, flow-through 제거 new EP tube 준비 14 : Elution: spin column을 새 tube에 옮기고 EB buffer 50ul를 가능한 column에 골고루 떨어뜨린다. 15. Standing 1min and centrifuge 1min, 13,000rpm

2. Enzyme reaction : Subcloning이 제대로 되었는지 확인하기 위해 transformation 된 E.coli에서 추출한 Plasmid DNA를 restriction enzyme으로 잘라 agarose gel electrophoresis 하여 확인 ~250ng/ul 정도의 plasmid DNA 2. Restriction Enzyme (HindⅢ, XbaⅠ) 0.5ul 3. 5X enzyme buffer 0.5ul 4. D.W total 5ul되도록 ℃, 1hour incubation 6. 6X gel loading buffer 1ul씩 첨가 7. Gel loading: DNA size marker 5ul, uncut plasmid 포함, loading 30min Warning !! : Enzyme temperature (-20℃) EtBr 작업시 polyglove 착용 (mutagen)

Restriction Enzyme Digestion of Plasmid DNA VectorDNACloned DNA volume(2 cut) DNA (xx ng/ul)1 ul3ul 5X restriction enzyme buffer 1 ul Restriction Enzyme Hind Ⅲ 0.5ul Hind Ⅲ 0.5ul Xba Ⅰ 0.5 ul H2O2.5 ul0.5 ul5ul Total5ul 10ul laneRestriction Enzyme bufferVolume (ul) 1marker3 2Vector Hind Ⅲ 25 3DNA Hind Ⅲ 25 4Cloned DNA Hind Ⅲ + Xba Ⅰ 25 5Cloned DNA Hind Ⅲ + Xba Ⅰ 25

실험에 사용한 DNA Marker