담당 교수님 : 김건수 교수님 담당 조교님 : 김익중 조교님 생명과학과 안혁근 서강대학교 Sogang university DNA microarray 를 이용 한 유전자 differential expression 정량측정 실험

Contents 1.Introduction 2.Method 3.Data & Result 4.Discussion

Introduction - Purpose High-throught 방법인 DNA chip 을 이용하여 조건에 따라 달리 발현되 는 세포 내 유전체상의 유전자들을 스크리닝하고 그들의 발현 양상을 정량적으로 분석한다. - Theory 배경 : 세포의 생명현상을 분자수준에서 이해하기 위해서는 세포 내의 유 전자들의 발현 양상을 파악하는 것이 중요 !! 몇 개의 유전자의 발현만 측정할 수 있는 Nothern hybridization 의 한계를 극복하기 위해 전체 유전체를 이루는 유전자들의 전사 정도를 동시에 측정 가능한 DNA microarray 등장 !!

Introduction DNA microarray 의 과정

Introduction 유전자 발현을 측정하기 위한 microarray 실험은 5 단계로 나눌 수 있다. 1 step : DNA chip 제작하는 단계. DNA chip 에는 수천에서 수만 종류 의 유전자 서열을 고정한 것이다. 2 step : 실험 조건에서 RNA( 역전사효소를 사용하여 RNA 로 부터 얻 어낸 cDNA) 을 추출하여 형광물질로 표지하는 단계. 3 step : 표지된 RNA(cDNA) 를 DNA chip 에 뿌려 혼합 (hybridization) 하는 단계. RNA(cDNA) 는 DNA chip 위의 유전자와 상보적인 결합을 한다. 4 step : RNA(cDNA) 와 반응한 DNA chip 을 스캐닝하여 이미지로 형 상화한 후 프로그램을 이용하여 유전자 위치마다 형광물질에 따른 발 색강도를 측정하는 단계. 형광 강도는 그 유전자의 발현정도를 알려준 다. 5 step : 정량화된 유전자 발현 수치 데이터를 분석하는 단계

Introduction Microarrayer 의 구성

Method 실험에서 사용한 균들 : S.typhi, S.flexneri, E.coli H7:0157, V.choleae, V.parahaemolyticus, V.vulnificus DNA chip 제작 1) 각 균들에서 뽑은 DNA 를 PCR 과정을 통해 증폭시킨다. -PCR(Polymerase Chain Reaction) : Template DNA, dNTP, Taq polymerase, primer 를 넣고 아래의 그 림과 같이 denaturation, annealing, extention 3 과정을 1 cycle 로 하여 30 cycles 정도 돌려준다.

Method

-PCR 과정시 주의해야 할 사항 : 올바른 primer 선택이 중요하다 Primer 선택시 주의해야 할 사항 20~25mer 정도의 염기가 바람직하다. 두 primer 가 비슷한 Tm 값을 갖도록 한다. GC 함량은 40~60% 로 하는 것이 좋다 Primer 끼리 결합하여 dimer 가 형성되지 않도록 한다. 부분적으로 GC 또는 AT 가 리치하지 않도록 하고 특히 primer 의 3 ’ 측면에 GC 가 리치하지 않도록 한다. 자기 상보 배열을 포함하지 않아 헤어핀 구조가 생기지 않도록 한다.

Method 2) PCR 이 제대로 되었는지 확인하기 위하여 electrophoresis 를 해준다. - agarose gel 의 well 에 dye 를 섞은 DNA 와 ladder 을 넣고 100V 의 전압을 걸어준다 분정도 전기영동을 해준 후 gel 을 EtBr 용액에 담구어 염색을 15 분 정도 해준 후에 UV 광학기를 통해 관찰한다.

Method 3) Elution 과정을 거친다. - PCR purification kit protocol Buffer PB 와 sample 을 1:5 의 비율로 섞고 mixture 을 spin column 에 옮겨준다. 1 분간 centrifuge 시키고 tube 에 걸러진 액체는 버린다. Buffer NW 700 ㎕ 을 넣고 1 분간 centrifuge 시키고 tube 에 걸러진 액 체는 버린다. Buffer NW 300 ㎕ 을 넣고 2 분간 centrifuge 시키고 tube 에 걸러진 액 체는 새로운 1.5 ㎕ tube 에 옮긴다. Buffer EB 50 ㎕ 을 spin column 가운데에 뿌리고 1 분간 기다린 후 그 다음 1 분간 centrifuge 시킨다.

Method - GEL kit protocol Elution 할 gel 을 자른 후 무게를 잰다. Tube 에 담아 gel 부피의 3 배만큼의 buffer GB 를 넣어준다. 50 ℃ 의 물에 agarose gel 이 잘 녹을 수 있도록 5~10 분간 넣어둔 후 2~3 분 마다 vortexing 해준다. Isopropanol 을 gel 의 부피만큼 넣어준 후 mixture 을 spin colmn 에 옮 긴다. 1 분동안 centrifuge 한 후 spin column 에 남은 용액을 버린다. Buffer NW700 ㎕ 을 넣고 5 분 동안 wash solution 이 흐를 수 있게 기 다린다. 1 분 동안 centrifuge 한 후 tube 에 남은 액체를 버린다.

Method Buffer NW 300 ㎕ 을 넣고 2 분 동안 centrifuge 한 후 spin column 을 새 로운 1.5ml tube 에 옮긴다. Buffer EB 50 ㎕ 을 spin column 의 가운데에 넣고 1 분간 centrifuge 한 다. 4) 만든 시료를 slide 에 spotting 한다. - DNA 의 농도를 DMSO 와 섞어 농도를 모두 25μg/ml(ng/μl) 로 맞춘다 well-microplate 에 arry pattern 을 고려하여 넣어준다. - Microarryer 로 slide 에 spotting 한다.

Method DNA 가 잘 붙도록 coding 된 슬라이드와 균들의 위치 P N P : Positive control N : Negative control 1 : V.cho 2 : V.par 3 : V.vul 4 : S.typhi 5 : S.flex 6 : E.coli 0157

Method DNA chip 에 뿌려 줄 시료 제작 1) 각 균들로 부터 RNA 를 추출하고 reverse transecriptase 를 이용하 여 cDNA 를 합성한다. ( RNA preparation kit 이용 ) 2)cDNA 에 Cy3 와 Cy5 를 labelling 한다. : 이 실험에서는 V.vulnificus 의 DNA 에 Cy3 를 cDNA 에는 Cy5 를 labelling 하여 DNA chip 에 뿌려주었다.

Method DNA chip 에 Cy3 와 Cy5 로 label 된 probe 를 hybridization 시킴. - 완성된 slide 위에 공기방울이 생기지 않게 뿌리고 cover slide 를 닿고 14 시간 정도 기다린다 시간 후에 slide 를 washing solution 으로 약 6 번정도 씻어준다. Hybridization 된 slide 를 scanner 로 관찰하고 분석한다.

Data & Result 각 균들의 PCR 결과 S.typhi primer 에 대한 결과 S.flexneri primer 에 대한 결과

Data & Result 각 균들의 PCR 결과 V.cholerae primer 에 대한 결과 E.coli 0157 primer 에 대한 결과

각 균들의 PCR 결과 Data & Result V.vulnificus primer 에 대한 결과 V.parahaemolyticus primer 에 대한 결과

Data & Result 각 균들의 PCR 을 한 결과를 electrophoresis 로 확인한 모습 : S.typhi 2 : S.flexneri 3 : E.coli H7: : V.choleae 5 : V.parahaemolyticus 6 : V.vulnificus

Data & Result Hybridization 된 slide 를 scanning 한 결과 Positive control V.vulnificus

Data & Result ( μg/ml(ng/μl)) Damaged substrate comet

Data & Result Damaged substrate, edge fading, low signal intensity

Discussion - Comet 이 나타난 이유 Slide 에 loading 할 때 DNA 의 농도가 너무 높았기 때문 DNA 가 slide 에 제대로 고정되지 못했기 때문 Slide washing 이 제대로 되지 않았기 때문 Slide 에 결함이 있기 때문 -Damaged substrate 가 나타난 이유 Cover slide 가 slide 표면을 긁어 손상되었기 때문 Washing 할 때 slide 표면이 손상되었기 때문 Spotting 할 때 핀이 slide 표면에 손상을 주었기 때문

Discussion -Edge fading 이 나타난 이유 Cover slide 를 덮을 때 target 을 희석시켰기 때문 Target 이 slide 에 고르게 펴지지 않았기 때문 -Low signal intensity 가 나타난 이유 시료가 불순수하거나 농도가 적당하지 않았기 때문 Hybridization 이 제대로 되지 않았기 때문 부적당한 RNA Labellng 이 제대로 되지 않았기 때문 Scanner 에 결함이 있기 때문

Microarray 의 전망 한 번의 hybridization 으로 매우 많은 정보를 얻을 수 있는 유용한 기술 필요한 시료의 양을 줄일 수 있게 개선 arrayer 의 가격을 낮춤 여러 실험에 보편화 기술로 자리 잡을 것이다. Discussion

Thank you.