3. Bacteriophage vector

박테리오파지 (bacteriophage): 박테리아를 숙주세포로 하는 바이러스 통칭 용균성 (lytic cycle); virulent phage 부착 – 주입 – 복제 – 조립 - 방출 용원성 (lysogenic cycle); 박테리오파지의 유전물질이 숙주세포로 유입된 후 숙주세포의 DNA에 포함되어 있는 형태로 존재하는 생활사 – 프로파지 (prophage) 온건성 파지 (temperate phage) ; 용균성과 용원성 모두 갖고 있음. λ 파지

Bacteriophage Attaching to a Bacterium

Quantification of Viruses 바이러스 복제 연구를 위해 바이러스의 정량이 필수적. Plaque 분석이 바이러스 감염성의 정량을 위한 가장 정밀한 방법임. plaque는 단일 바이러스 입자의 감염 결과임. 세균을 감염한 phage 가 생성한 plaques 기주세포에 의한 lawn

plaque Plaque forming unit (PFU)

바이러스의 lysozyme 유사 효소가 작용하여 세포벽에 작은 구멍을 형성함. Lysozyme: peptidoglycan 분해효소 기주의 바이러스 침입에 대한 저항 기작: restriction – modification Restriction: 외부 침입 DNA 분해, modification: 자신의 DNA 보호 바이러스의 침입: 바이러스 genome 이 single strand 이거나 RNA 바이러스 genome이 glycosylation 또는 methylation 됨

Regulation of lambda Repressor (cI) cI Lysogenic Cro Lytic

Phagemids; 박테리오파아지 DNA 벡터 λ파아지 M13 파아지 게놈 dsDNA ssDNA 특징 lysogenic and lytic lytic 크기 49kb 6.4 kb 용도 library (cDNA, genomic DNA) DNA sequencing in vitro mutagenesis 감염 in vitro package, conjugation conjugation

Lamda phage Figure 2.20a Genomes 3 (© Garland Science 2007)

λ 박테리오파아지에 기초한 클로닝 벡터 해결해야할 문제 49kb 분자의 5% 증가, 3 kb 이하 절편 분자 전체 크기가 52 kb 이상이면 머리구조로 조립 안되며 파아지 입자 형성되지 않음 λ 유전체는 매우 크기 때문에 실제적으로 모든 제한효소에 하나 이상의 인식 염기배열을 가지고 있다 다양하게 개발; 5-25 kb 단편 클로닝 제거해도 상관 없음 15 kb 삽입과 절단 비용원성; 박테리아 DNA 삽입X

12-base-G-C-rich cohesive sticky ends Figure 2.21 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

비필수 지역의 큰 단편이 제거되어 두 팔이 서로 봉합 λgt10; 8kb 절편 운반 λ 파아지 삽입 벡터 비필수 지역의 큰 단편이 제거되어 두 팔이 서로 봉합 λgt10; 8kb 절편 운반 삽입 비활성화는 재조합 분자가 혼탁한 plaque가 아니라 투명 plaque 확인; 비용원성 λZAPII; 폴리링커 내에 6 개중 어떤 제한 부위로 10 kb 까지의 새로운 DNA 삽입하면 벡터가 운반하는 lacZ 유전자가 비활성화 ; X-gal 첨가에 의해 무색 플라크 형성 EcoRI 제한부위가 없는 λ 파아지 분리위해 자연선택 방법

치환 벡터 λEMBL4; 쌍으로 된 EcoRI, BamHI, SalI 20kb 단편 운반; Spi 표현형 (P2 파아지 갖는 박테리아 이용) λGEM11, λGEM12; 23kb 치환능력

박테리오파아지 DNA의 제법 λ 파아지 적정량 titre 1ml 당 파아지 입자수 1010/1ml = 500 ng 500-1000ml cI 유전자; 파아지를 삽입상태로 유지시키는 유전자 돌연변이에 의해 비활성화시켜 cI 유전자의 기능 비활성화 30도에서 42 도로 바꿈으로서 λ 파아지 cI ts 용원균의 유도

Non-lysogenic 비용원성 λ 파아지의 배양시기와 접종제의 크기 사이에 알맞은 균형의 성취 감염된 배양액에서 파아지 수집 파아지 입자가 원심분리에 의해 현탁액에 존재 Polyethylene glycol PEG와 함께 침전

M13 DNA 정제의 문제점 M13 이중가닥 복제형 플라즈미드가 높은 사본수의 플라즈미드와 같이 행동하므로 플라즈미드 정제의 표준 방법에 의해 쉽게 정제 EtBr-CsCl 밀도 기울기 원심분리 density gradient centrifugation 1012/ml 5 ml 이하 적은 부피의 배양 PEG 침전, 단백질 외피를 제거하기 위한 페놀 추출, DNA 농축하는 에탄올 침전법 λ 파아지 입자에서 DNA 정제 PEG 침전물에서 원하지 않는 세포 찌꺼기와 필요없는 세포 DNA를 포함 CsCl 밀도 기울기 원심분리 1.45-1.5 g/cm3 사이의 band

박테리아 세포로 파아지 DNA 도입 Transfection; 정제된 파아지 DNA 혹은 재조합 파아지 분자가 반응능 대장균 세포와 혼합하여 열에 의한 충격에 의해 DNA 삽입 In vitro pakaging; 시험관에서 조립 파아지 감염은 아가배지에서 plaque 투명지역

재조합 파아지 확인 1. 파아지 벡터가 지닌 lacZ 유전자의 삽입 비활성화 Β-galactosidase 합성 비활성화 2. 재조합 분자는 X-gal 한천위에 보통 파아지는 파랑색 plaque 재조합 plaque는 투명 λcI 유전자에 삽입 비활성화는 turbid plaque 혼탁, 손상된 cI 유전자를 가진 재조합 분자는 투명 clear 3. Spi 표현형을 사용하는 선택 λ 파아지는 P2 파아지의 삽입 형태를 이미 가지고 있는 대장균 세포 를 감염시킬 수 없다. 그러므로 λ 는 Spi+(sensitive to P2 prophage Inhibition)라고 한다. 어떤 λ 클로닝 벡터는 새로운 DNA 삽입이 Spi+로부터 Spi-로 변화가 일어나도록 고안되어 있으므로 재조합 분자는 P2 프로파아지를 운반하는 세포를 감염시킬 수 있다. 즉, 재조합 분자만 Spi-이므로 재조합 분자만이 plaque를 형성 4. λ 유전체 크기에 기초한 선택 성숙된 파아지 입자로 짜맞추는 λ 조립방법은 37과 52 kb 사이의 DNA 분자만을 머리구조로 삽입. 37 kb 이하는 어떤 것도 조립 되지 않는다. 재조합 파아지만 복제 가능.

M13 파아지 DNA pGEM3Z-클론된 DNA의 생체외 전사 pGEM3Z; pUC 벡터와 유사 두개의 여분의 DNA 짧은 단편; RNA 중합효소의 부착에 대한 인식 부위 T7 박테리오파아지, SP6 파아지 RNA 중합효소에 대해 특이성을 가지고 있다. 1분당 1-2 μg RNA 합성 M13 파아지 DNA

M13 섬유성 박테리오파지 ssDNA 100 copy 이상 복제 E. coli pilus (편모)에 의해 주입 6.4 kb Replicative form (RF); 플라즈미드 유사 단일가닥 DNA 얻음 -시험관내 돌연변이 생성 (in vitro mutagenesis) - sequencing

M13mp7p; lacZ EcoRI site에 폴리링커 (제한부위) 삽입 M13 벡터의 단점; 클론될 수 있는 DNA 단편의 크기에 한계 최대 1.5 kbp 단편 클로닝

파지미드(phagemids); M13 유전체의 일부를 플라즈미드 DNA와 결합 pEMBL8; 혼성(hybrid) 플라즈미드-M13 벡터 최대 10kb 단편 클로닝 가능 M13 유전체 1300 bp 단편을 pUC8로 전이 단일사슬 DNA로 바꾸는 효소에 인식되는 신호 염기배열을 포함

Large insert DNA vectors Cosmid: E. coli origin of replication + cos site of lambda Fosmid: F plasmid ori (oriS) + cos site of lambda parB parA repE oriS CM BamHI HindIII cos pFOS1 9.5 kb AatII

Yeast Artificial Chromosome (YAC) Figure 2.25 Genomes 3 (© Garland Science 2007)

Large DNA insertion vectors : 100 – 1,000 kb DNA insertion. BAC – Bacterial artificial chromosome (6.7 kb) YAC – Yeast artificial chromosome TEL: telomere ARS: autonomous replication sequence CEN: centromere

코스미드 cosmid 파아지 DNA 분자와 박테리아 플라즈미드 혼성 Cos 부위를 가진 플라즈미드 선별표식자, ori, plaque생성하지 않고 colony 형성 40kb 운반 큰 DNA 단편을 클론하는 능력; genomic library P1 박테리오파아지 110 kb 75-100 kb 운반 F 플라즈미드에 기초한 박테리아 인위 염색체 Bacterial artificial chromosome BAC 300 kb 인간 genomic library에 필요한 클론수 λ 코스미드 2570000 P1 90000 BAC 30000