분자표지를 활용한 고순도 무 복교잡종 육성 박수형, 이수성, 윤무경, 목일진 원예연구소 채소과 Developing highly uniform double-crossed variety using PCR-based selection in radish Suhyoung Park 원 예 연 구 소 01 / 20

자가불화합 인자형 class 판별 가능 프라이머 분자표지 MAS Marker Assisted Selection 분자표지를 활용한 선발 (육종의 수단) 분리 세대의 모든 개체로부터 1립씩 종자를 채종하고, 혼합하여 세대를 진전시키는 육종법 단주계통법 Near-Isogenic Lines; 자식을 여러 번 실시하여 유전적으로 거의 고정이 된 계통 NILs 원 예 연 구 소 02 / 20

복교잡에 의한 품종 육성(AxA’) X (BxB’) 장점 : 자가불화합인 양친 종자 증식 가능 단점 1. F1품종의 순도가 낮음(약 80%) 2. 조합능력 검정이 복잡함 활용 : 알타리무, 열무 (’70년대 순도 낮아 실패, 이후 성공) 단교잡에 의한 품종 육성(A X B) 장점 1. F1품종의 순도가 높음(약 90%) 2. 조합능력 검정이 간단함 단점 : 양친 종자 증식이 어려움 활용 : 대형무(가을무) 원 예 연 구 소 03 / 20

단교잡 무 품종 육종 사례 소개(태백무) 재래종(송정쥐꼬리, 용현,중국청피 등) 수집-1962 특성, 수량조사 →계통 순화(계통 육종법) 자가불화합 검정 (격리포장 재배법) 가능한 먼 거리의 지방종간 교배조합 작성 우수 조합 선발 (울산재래 × 서울무들) 태백무 품종 등록(1974) 해남, 장항(3만평)채종 : 6석(1200L) 생산(1975) 채종량이 적어 품종 생산 중단 의논(’75년 8월) CO2를 이용한 양친 채종법 개발(1978) 원 예 연 구 소 04 /20

Parental seed production CO2 처리에 의한 자가불화합성의 일시적 타파 CO2 Container CO2 Controller Parental seed production CO2 treatment 5 / 20 원 예 연 구 소

고순도 복교잡 품종 육성(AxA) X (BxB) 장점 1. F1품종의 순도가 높음(약 90%) 2. 조합능력 검정이 간단함 3. 양친 종자 증식 용이 단점 : 양친 개발이 어려움 (매세대 분자표지로 자가불화합 인자형이 서로 다른 개체 선발) 활용 : 다양한 무 품종 및 조합작성 재료 원 예 연 구 소 06 / 20

배추과 작물의 자가불화합성 (Franklin-Tong, 2002.) 원 예 연 구 소 07 / 20

단주계통법 × A 품종 B 품종 F1 ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● F2 F3 ● ● ● ● ● ● F4 50개체 양성 ● ● ● ● ● ● F2 5,000개체 전개, 개체별 1립 채종 혼합 F3 ● ● ● ● ● ● 5,000개체 집단재배, 개체별 1립 채종 혼합 F4 ● ● ● ● ● ● 5,000개체 집단재배, 개체별 모두 채종 F5 I I I I … I I I 5,000 계통재배, 50계통 선발, 계통별 집단채종 F6 I I I I … I I I 계통 당 30개체씩 재배, 10계통 선발 및 채종 … F7~9 10 계통 생산력 검정 반복, 3계통 선발 F10~12 3 계통 적응성 검정 반복, 1계통 선발 F13~15 신품종 종자 증식 원 예 연 구 소 08 / 20

분자표지를 활용한 선발 원 예 연 구 소 09 / 20

자가불화합성 관련 연구 Sporophytic SI : 배추과의 self 화분은 주두에서 발아가 억제됨 In Brassica spp, SI is controlled by - a highly polymorphic locus(S locus) - at least two physically linked genes in the stigma(SLG, SRK) and a pollen gene(SCR) 분류 : 우열관계-4 type (haruta, 1962), 염기서열 유사성-2type (Nasrallah et al.,1991) calss I ; pollen dominant over class-II, strong SI response class II ; recessive, weaker SI response 원 예 연 구 소 10 / 20

주두측 SI 결정인자(SRK, SLG) SRK 유전자 형질전환체 : SI 반응 일으킴(Hatakeyama et al., 2001) SLG : a stigma glycoprotein abundantly present in the papillar cell (Takasaki et al 2000) SLG와 SRK의 extracellular domain은 유사 (Nishio and Kusaba 2000) SLG와 SRK 형질전환체 : stronger SI response than SRK alone SLG alone cannot show SI → 보조적인 역할 (Takasaki et al 2000) 배추 antisense-oriented SLG 형질천환체: self-compatible expression of SLG/SRK in stigma was decreased (Shiba et al 2000) 원 예 연 구 소 11 / 20

SI 반응 모식도 : bind to the kinase domain of SRK Fig. A schematic model for the SI signaling pathway. When the pollen grain with an S9 phenotype, is put on the papillar cell of stigma of S9 (incompatible combination), the male S determinant, SP11/SCR, is released and taken into the wall of a papillar cell. The SP11/SCR molecule should I nteract with the S domain of SRK. The SLG molecule would function to stabilize the SI recognition reaction, and might solely interact with SP11/SCR molecule in the cell wall. The kinase domain of the SRK activated by SP11/SCR interaction could phosphorylate the ARC1 molecule in the cytoplasm. After the subsequent signal transduction, the pollen could not germinate, or the pollen tube growth is inhibited by an unknown mechanism. In contrast, in the case of the compatible combination, the pollen grain whose S phenotype was S8, the SP11/SCR of S8 did not recognize the female S determinant, SRK9 molecule. Thus, the pollen grain could germinate, and the pollen tube penetrated the cell wall of the papillar cell. The genes encoding the SI-related molecules except ARC1 resided at the S locus, and were tightly linked to each other.(Watanabe et al 2001) ARC1(arm repeat-containing protein) : bind to the kinase domain of SRK Introducing of antisense-oriented ARC1 into SI plant : partially self-compatible (Stone et al 1999) 원 예 연 구 소 12 / 20

무 SI 인자형 동정 기술 : PCR-RFLP 무 24개 계통 분석 (Lim et al., 2002) 무 24개 계통 분석 PCR with class-I SLG primers + Enzyme cutting : 5 type PCR with class-II SLG primers + Enzyme cutting : 2 type PCR with class-I SRK primers + Enzyme cutting : 9 type 원 예 연 구 소 13 / 20

PCR-RFLP에 의한 시판 무 품종의 SI typing TaqI HspI M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 M 18 19 20 21 22 2 3 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 Fig. 1. Polyacrylamide gel electrophoresis of TaqI and HspI digested PCR products amplified with class-I SLG specific primer pair of commercial radish cultivars HspI HinfI M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 M 25 26 27 28 29 30 31 32 33 3435 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 Fig. 2. Polyacrylamide gel electrophoresis of HspI and HinfI digested PCR products amplified with class-II SLG specific primer pair of commercial radish cultivars 원 예 연 구 소 14 / 20

S-locus의 형태와 본 실험에 사용된 프라이머 (Nasrallah, 2000 ) (Lim, 2002) 원 예 연 구 소 15 / 20

분자표지에 의한 무 SI 인자형 선발 및 육종 무 45 품종 SI 인자형 동정 : 32 가지의 자가불화합 인자형 발견 복교잡 품종 육성 위해 각각 인자형, 생태형이 다른 4품종 선발 A집단 : S4S5×S1S17 → S4S1/S4S17 /S5S1/S5S17 B집단 : S8S26×S21S30 → S8S21/S26S30 /S8S30/S26S21 선발 : PCR-RFLP→ PCR, SCAR → PCR, Sequencing or CAPS NILs 육성 : F1- 각 집단에서 300립파종 F2- 개체당 5립 파종, 4립 PCR 검정, 이형접합체 1개 선발 F3~F6 – 상동 원 예 연 구 소 16 / 20

NILs의 활용방안 : 1 고순도 복교잡 품종 육성 조합능력 검정 : F4~F5 순도 확인 : F6 세대 SI homo 계통 교배 (단교잡) SI homo×SI hetero (3원교잡) SI hetero 계통 교배 (복교잡) 양친 증식 : F6 SI homo 개체 선발(분자표지) 종자 증식 (격리 포장 이용) 잡종종자 생산 단교잡 3원교잡 복교잡 원 예 연 구 소 17 / 20

NILs의 활용방안 : 2. 웅성불임성 품종 육성 S msms N msms X 계통 증식 문제 해결 S S/N msms 무의 웅성불임 : CGMS 세포질 웅성불임 유전자 : S, 핵내 웅성회복 인자 : RfRf 잡종종자 생산 S msms N msms X 계통 증식 문제 해결 웅성불임친 유지친(B) S S/N msms Rfrf/rfrf X 웅성불임친 회복친(C, R) 일대 잡종 종자 생산 원 예 연 구 소 18 / 20

NILs의 활용방안 : 3. 순도 100% 품종 육성 X X S1S1 S2S2 S1S1 S1S2 S2S2 S1S2 S2S2 기존 단교잡 품종 : 순도 90% ← 환경 및 식물체 노화에 따른 자가불화합 회피 및 타파 발생 양친이 유전적으로 동일하나 SI 인자형만 다를 경우 자식이 일어나도 순도에는 영향을 미치지 못함 (새로운 단교잡 품종 : 순도 100%) ← 품종 보호 취약 문제 발생 : 분자표지 개발로 대비 S1S1 X S1S2 90% S2S2 5% X S1S1 S2S2 90% 5% 5% S1S2 S1S1 S2S2 원 예 연 구 소 19 / 20

Reference 식물육종학, 1999, 향문사, 김광고 등 Nasrallah, J.B., T. Nishio, and M.E. Nasrallah. 1991. The self-incompatibility genes of Brassica: Expression and use in genetic ablation of floral tissues. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 42:393–422. Watanabe, M, K. Hatakeyama, Y. Takada, and K. Hinata. 2001. Molecular aspect of self-incompatibility in Brassica species. Plant Cell Physiol. 42:560-565. Shiba, H., N. Kimura, S. Takayama, K. Hinata, A. Suzuki, and A. Isogai. 2000. Alteration of the self- incompatibility phenotype in Brassica by transformation of the antisense SLG gene. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 64:1016–1024 Hatakeyama, K., T. Takasaki, G. Suzuki, T. Nishio, M. Watanabe, A. Isogai, and K. Hinata. 2001. The S receptor kinase gene determines dominance relationships in stigma expression of self-incompatibility in Brassica. Plant J. 26:69–76. Takasaki, T., K. Hatakeyama, G. Suzuki, M. Watanabe, A. Isogai, and K. Hinata. 2000. The S receptor kinase determines self-incompatibility in Brassica stigma. Nature 403:913–916. Stone, S.L., M. Arnoldo, and D.R. Goring. 1999. A breakdown of Brassica self-incompatibility in ARC1 antisense transgenic plants. Science 286:1729–1731 Lim, S.H., W.J. Cho, S.J. Lee, Y.H. Cho, and B.D. Kim. 2002. Identification and classification of S haplotypes in Raphanus sativus by PCR-RFLP of the S locus glycoprotein (SLG) gene and the S locus receptor kinase (SRK) gene. Theor. Appl. Genet. 104:1253–1262. 원 예 연 구 소 20 / 20