Small RNA를 매개로 한 유전자 조절 네트워크 김빛내리 서울대학교 RNA유전체학 연구실 Opening a new horizon- RNomics Lab

How much do we know about our genome? Known function (known genes) Unknown function 97% Transcriptome Noncoding RNAs (11,665) Coding RNAs (exon) Coding RNAs (4,258) Non-coding RNAs (including introns) 98% (Mattick, 2001) Total 60,770 full-length clones (RIKEN genome research group, 2002)

non-coding RNA 연구의 중요성 유전자 조절 네트워크의 주요 구성요소 중요성에도 불구, 미개척 분야임 기초 연구 Genome의 기능과 다양성 설명 질병의 분자적 기반 이해 신개념의 기반기술 창출 유전자, 세포 조절 기술 질병 치료 기술

~22 nt (19-28 nt) single-stranded RNA Small RNA : 새로운 종류의 생체 조절 물질 ~22 nt (19-28 nt) single-stranded RNA RNA interference (RNAi) Translation 저해 Heterochromatin 형성 (in S. pombe) Chromosome 재조합 (in Tetrahymena)

Small RNA의 종류 miRNA (microRNA) siRNA (small interfering RNA) Known function Developmental control etc RNA interference Origin Endogenous Stem-loop RNA Exogenous/endogenous long dsRNA Protein factors Dicer, Argonaute proteins Binding to target mRNA Imperfect match, multiple binding sites Perfect match Action mechanism Translational inhibition mRNA cleavage

miRNA 와 siRNA 는 밀접하게 연관되어 있다. miRNA pathway siRNA pathway miRNA 와 siRNA 는 밀접하게 연관되어 있다. 포유동물에서는 miRNA가 주종을 이룬다. miRNA siRNA Perfect Pairing Imperfect pairing

microRNA란? 19-25 nt ssRNAs stem-loop 형태의 전구체에서 생성됨. 계통적 보존도가 매우 높음. 식물과 동물에서 종 별로 수 백 가지씩 존재. 발생, 분화, 발암 과정 등에서 기능함. (Moss, 2002, Current Biology)

microRNA genes Location intergeneic region (~55%) antisense to a gene (~11%) intron, sense (~33%) Independent transcription unit ? Dependent on the hosting gene’s transcription ? Gene distribution pattern isolated genes clustered genes (> 50%)

Transcription and maturation of miRNA Polycistronic ? Gene (operon?) Primary transcript ? Pre-miRNA Mature miRNA At least two processing events ?

Long transcripts containing miRNAs RT-PCR from HeLa total RNA

In vitro processing system In vitro transcription 293T cells T7 NTP T7 polymerase P-UTP 32 * Uniformly labeled miRNA precursor Cell lysate 32 C, 90 min o * * * * * * * * * * * * * * * * * Denaturing polyacrylamide gel

Stepwise processing of microRNAs The input RNA containing miR-30a and its surrounding sequences was processed only in the presence of cell extract. In contrast, the antisense RNA was not processed, indicating that this cleavage is not due to non-specific nuclease activity. Interestingly, the sizes of the two fragments were around 65nt and 23nt, which are reminiscent of pre-miRNA and mature miRNA. The identity of these fragments were later confirmed by gel purification and primer extension. So the input RNA was processed to mature miRNA through at least two steps in vitro. The long transcripts are processed in a stepwise manner in vitro.

Compartmentalization of miRNA processing Subcellular fractionation followed by in vitro processing The first step occurs mainly in the nucleus. The second step is confined in the cytoplasm.

Model for microRNA biogenesis (Lee et al., EMBO J, 2002) Maturation of miRNA occurs through at least two steps. The two steps are compartmentalized into the nucleus and the cytoplasm. Pre-miRNAs may serve as the substrate for nuclear export. Regulation of miRNA biogenesis may occur at multiple levels.

Cis-acting requirements? Trans-acting factors? Cropping Dicing

Determination of the cleavage sites

Determination of the cleavage sites 2-nt 3’ overhang on the product Such 3’ overhangs are characteristic of the products of cleavage reactions catalyzed by Rnase III.  RNase III type nuclease ?

RNase III type proteins Require dsRNA structure; Generate 2-nt 3’ overhangs; Require divalent cations (Mg2+) for catalysis. Dicer L44 Drosha Helicase PAZ RIII-a RIII-b dsRBD RIII Domain organization Subcellular localization Cytoplasm Mitochondria Nucleus

In vitro processing of pri-miRNA by Drosha Expression of Drosha-FLAG in 293T cells Immunopurification using anti-FLAG antibody In vitro processing

Effects of Drosha RNAi Transfection of synthetic siRNA into HeLa cells 3 or 7 days RNase Protection Assay Drosha acts in the initiation step of miRNA maturation.

Effects of Drosha RNAi Drosha is widely used for miRNA production. Transfection of synthetic siRNA into HeLa cells 7 days Northern blot analysis Drosha is widely used for miRNA production.

microRNA biogenesis (Lee et al., Nature, 2003) Stepwise processing is mediated by two RNase III proteins, Drosha and Dicer. Drosha and Dicer may be the key players in the regulation of development and differentiation. Cropping Drosha Dicing Dicer

Exportin-5 mediates pre-miRNA export Lund et al. (2003) Yi et al. (2003) Bohnsack et al. (2004) Cropping Drosha Exportin-5 Dicing Dicer

miRNA를 매개로 한 조절 네트워크 miRNAs Anti-viral defense ? Cell differentiation Target (mRNA) Cell division/ apoptosis Developmental control Transposon silencing ? Heterochromatin formation

miRNA-directed regulatory networks Signal 1 Signal 2 Signal 3 miRNAs Primary targets Secondary targets Response 1, 2, 3, …

해결하고자 하는 연구 과제

배아줄기세포에서의 microRNA 네트워크 연구 일정 조건에서 여러 종류의 세포로 분화할 수 있으므로 분화 연구에 적합하다. 무제한 증식할 수 있으므로 다른 줄기세포와는 달리 다량의 세포를 얻을 수 있다. 배아발생 연구에 뿐만 아니라 세포 치료에 응용될 수 있다.

인간 배아줄기세포에서 클로닝한 microRNA (Suh et al., Developmental Biology, 2004) ES cell specific miRNA

미분화 배아줄기세포에서 특이적으로 발현되는 microRNA Northern blotting RT-PCR

Biochemistry and Biophysics Team Molecular Genetics Team Bioinformatics Team miRNA processing element 규명 miRNA 유전자구조 와 전사기작 규명 microRNA target prediction miRNA interacting protein 동정 인간 배아줄기세포에서 miRNA 발현 분석 microRNA database 구축(microRNA EST clustering) miRNA 기능연구 (Reporter assay) Drosha and Dicer 구조 규명 miRNA 기능연구 (knockdown) miRNA interacting protein 특성 분석 microRNA 유전자 예측 miRNA 기능연구 (knockout mice) 배아 발생과 세포분화에 있어서의 microRNA network 이해 인간 질환에 있어서의 microRNA network 이해 새로운 유전자 조절 기술 개발

RNA interference dsRNA-induced silencing of the homologous gene

Small-scale functional study Genome-wide screening Application of RNAi Functional Genomics Gene Therapy Small-scale functional study Viral infection Genome-wide screening RNAi Cancer Transgenic study Genetic disorder

microRNA pathway siRNA pathway miRNA vs. siRNA The miRNA pathway and siRNA pathway share common components. miRNA siRNA Perfect Pairing Imperfect pairing (Zamore., 2002, Curr. Opinion in Gen. Dev.)

RNAi in mammalian cells

RNAi의 효율에 영향을 미치는 인자 1. mRNA 상의 표적 지점 2. siRNA 생성/도입 방법 - intron은 피해야 하고, UTR 보다는 ORF 부위가 좋다. - 강한 secondary structure가 없는 부위가 좋다 (MFOLD) - 다른 mRNA와 비슷한 서열이 있는지 없어야 한다 (BLAST) 2. siRNA 생성/도입 방법 - synthetic siRNA (transient silencing, 3-5 cell doubling time) / DNA-based shRNA (stable silencing) - transfection / transduction (cell의 종류에 따라)

RNAi의 효율에 영향을 미치는 인자 3. RNAi 의 지속성과 단백질의 반감기 4. multiple silencing - 따라서, turnover rate가 낮은 안정적인 단백질의 경우는 DNA-based method (shRNA) 를 사용하거나, 2회 이상 transfection을 해준다. 4. multiple silencing - 여러 개의 target을 동시에 제거하기를 원하는 경우, 주의하여 적합한 조건을 찾아야 함. - RNAi에 필요한 cellular factor들이 제한되어 있다고 생각되기 때문.

siRNA duplex 디자인 1. ORF 안의 서열을 타겟으로 정하는 것이 좋다. 2. AAN19TT, NAN19NN, NARN17YNN 3. 전체적인 GC ratio는 32-50%사이인 것이 좋다. 4. 반복적인 서열 (특히 GC stretch)는 피하는 것이 좋다.

siRNA duplex 디자인 5. antisense strand의 5’ 말단의 duplex가 불안정한 것이 좋다. 6. target mRNA 기준으로 3’ 말단에 A/U pair나 약간의 bulge가 생기는 것이 좋다. 7. target mRNA 기준으로 A19, A3, 1G, 1C가 오는 것이 좋다. 8. target mRNA 기준으로 U10이 오는 것이 좋다. 9. 디자인이 끝난 후 BLAST를 통해 17 nt 이상이 결합하는 비특이적 타겟이 있는지 확인한다.

siRNA duplex 디자인 9. 디자인이 끝난 후 BLAST를 통해 17 nt 이상이 결합하는 비특이적 타겟이 있는지 확인한다. 10. 보통 2-4가지 siRNA를 디자인하여 테스트한다. 11. Specificity를 확신하기 위해서는: - GFP siRNA, scrambled siRNA등 세포내의 mRNA를 타겟하지 않는 siRNA를 negative control로 사용한다. - 한 mRNA에 대해 두 가지 이상의 siRNA로 RNAi한 후 같은 결과를 얻어야 한다.

siRNA duplex 디자인

RNomics Lab 이윤태 김영국 한진주 염규현 김화 Collaborators 서미라 김계성 (포천중문의대) Opening a new horizon- RNomics Lab