제3장 생물공학 실험설비 및 배양용 배지 1. 기본 시설 및 기구 제3장 생물공학 실험설비 및 배양용 배지 1. 기본 시설 및 기구 세척 시설-세척대, 건조대, 1회용 제품으로 대체(페트리디쉬, 피펫) 배지조제 및 멸균시설 - 2차 증류수기 - 고압멸균기(autoclave,15psi, 121℃) - 필터멸균 (0.22µm), gamma ray, Ethylene oxide gas - chemical balance, stirrer, pH meter, microwave oven, clean bench - Culture room - 관찰 및 분석 시설: 현미경(광학, 입체, 형광, 도립), 전기영동장치, 원심분리기,스펙트로 미터, PCR

2. 조직배양 가. 배지조성 - 무기염류 - 탄소 및 에너지원 - 기타유기물 - 비타민류 - 생장조절제 -기타첨가물

가. 배지조성 - 무기염류 : 다량(macro) 및 미량(micro) 원소 질소원: 아미노산, 단백질 및 핵산의 구성성분 Mg, Zn, Fe: 효소의 cofactor Mg: 엽록소 구성성분, 생장, 형태형성에 필수

가. 배지조성 및 종류

가. 배지조성 - 비타민 류:

가. 배지조성 - 탄소 및 에너지원: Sucrose 에너지원 및 삼투압제 농도에 따라 식물체 형태발생 반응 다양 예) 백합: 3%-자구형성, 9%-자구형성율 극히 저조

가. 배지조성 - 기타 유기물: 아미노산, Urea- 질소원, 형태형성 및 체세포배 형성 카제인-아미노산, 캴슘 및 인 풍부 글루타민, 아스파라진- 환원질소원

가. 배지조성 - 생장조절제(Plant growth regulators,PGR) - Auxin, - Cyotokinin - Ethylene - ABA(Abscisic acid), - Gibberellic acid (GA3)

Auxin 줄기와뿌리에서 세포분열 - 캘러스유기에 효과

Auxin Functions of Auxin Stimulates cell division in the cambium and, in combination with cytokinins in tissue culture Stimulates differentiation of phloem and xylem Stimulates root initiation on stem cuttings and lateral root development in tissue culture Mediates the tropistic response of bending in response to gravity and light The auxin supply from the apical bud suppresses growth of lateral buds Delays leaf senescence Can inhibit or promote (via ethylene stimulation) leaf and fruit abscission Can induce fruit setting and growth in some plants Involved in assimilate movement toward auxin possibly by an effect on phloem transport Delays fruit ripening Promotes flowering in Bromeliads Stimulates growth of flower parts Promotes (via ethylene production) femaleness in dioecious flowers Stimulates the production of ethylene at high concentrations

Auxin 적용 실지 예

Cytokinin 아데닌(Adenine) 유도체 세포분열 자극 눈형성 유도

Cytokinin Cytokinin Functions Stimulates cell division. Stimulates morphogenesis (shoot initiation/bud formation) in tissue culture. Stimulates the growth of lateral buds-release of apical dominance. Stimulates leaf expansion resulting from cell enlargement. May enhance stomatal opening in some species. Promotes the conversion of etioplasts into chloroplasts via stimulation of chlorophyll synthesis.

Cytokinin 적용 실지 예

GA, Ethylene, ABA 지베렐린(Gibberellin) - 100여종 - 세포 및 줄기 신장 에틸렌(Ethylene) - 후수호르몬 - 세포분열 저해 - 옥신양에 좌우 ABA (Abscisic acid) - 증산억제제 - 체세포배 유도 촉진

ABA Functions of Abscisic Acid Stimulates the closure of stomata (water stress brings about an increase in ABA synthesis). Inhibits shoot growth but will not have as much affect on roots or may even promote growth of roots. Induces seeds to synthesize storage proteins. Inhibits the affect of gibberellins on stimulating de novo synthesis of a-amylase. Has some effect on induction and maintanance of dormancy. Induces gene transcription especially for proteinase inhibitors in response to wounding which may explain an apparent role in pathogen defense.

ABA 적용 실지 예

Ethylene Ethylene H2C=CH2 Functions of Ethylene Stimulates the release of dormancy. Stimulates shoot and root growth and differentiation (triple response) May have a role in adventitious root formation. Stimulates leaf and fruit abscission. Stimulates Bromiliad flower induction. Induction of femaleness in dioecious flowers. Stimulates flower opening. Stimulates flower and leaf senescence. Stimulates fruit ripening.

Ethylene 적용 실지 예

GAs Functions of Gibberellins Stimulate stem elongation by stimulating cell division and elongation. Stimulates bolting/flowering in response to long days. Breaks seed dormancy in some plants which require stratification or light to induce germination. Stimulates enzyme production (a-amylase) in germinating cereal grains for mobilization of seed reserves. Induces maleness in dioecious flowers (sex expression). Can cause parthenocarpic (seedless) fruit development. Can delay senescence in leaves and citrus fruits.

GA3 적용 실지 예

가. 배지조성 - 한천 (agar)

배지종류 및 이용

제4장 식물조직배양 단계별 문제점 배양과정 시료준비: 모식물의 유지 관리 초기배양 단계: 배양재료의 살균 및 새로운 생장 유도 단계 대량증식단계: 배양체로부터 다경(multiple shoot) 유도 단계 신장과 발근 단계: 기외이식에 필요한 제반 조건 부여 기외이식 단계: 정상환경 조건에 적응

2. 단계별 유의 사항 가. 시료의 준비 단계: 배양재료의 오염문제를 해결 하는 것이 중요 모주의 재배 - 온실 혹은 생장상에서 배양 - 습도유지는 낮게 - 화분 혹은 점적관수 - 유기질 비료는 덜, 살균제 산포 - 최소한 3개월 유지

2. 빛, 온도 및 생장조절물질의 영향 가) 광: 적색광, 원적색광 처리 나) 온도 - 저온처리: 휴면타파, 목본류, 백합(4℃)-자구생장 촉진 - 고온처리: 딸기, 35-38 ℃,바이러스 제거 다) 생장조절제 처리 - 목련: 500mg/L BA를 줄기에 관주 - 밤, 칠엽수: BA 및 GA처리-세포활성 증가

나. 초기배양 단계 1) 배양재료의 선정 - 절편의 크기, 가장 우수한 기관의 선정, 배양재료의 생장 단계 - 재료의 채취시기, 배양재료 채취로 인한 스트레스 고려 가) 배양절편의 크기

나. 배양기관 - 대부분 shoot tip 혹은 axillary, bud - 간혹 leaf segment

다) 배양재료의 생육단계 - 어린조직이 분화율이 높음 - 분화능의 차이: 조직내의 생장촉진물질과 억제물질과의 수준차

라. 배양재료의 계절적 재생력의 차이 - 하계: 페놀(phenol)성 물질로 인해 현저히 감소

2) 배양재료의 반응 페놀성 물질 방출: 산화되어 불안정한 물질 방지하기 위해 Mn(peroixdase) , Cu(phenolase) 이적은 배지 선택 배양초기에는 cytokinin 사용 않음 활성탄 첨가 빈번한 계대배양 산화방지제 첨가 PVP(polyvinylpyrolidone) DTT(Dithiothreitol) Phloroglucinol 등

3) 배양재료의 오염 및 살균 가) 배양배지의 오염 나) 오염원의 진단: 병징(symptoms), 표징(Signs) (1) 바이러스 검정: 지표식물검정, 전자현미경적, 열청학적 검정 (2) 세균과 세균병원체의 검정 - 생화학 kit 혹은 DNA probe방법 (3) 진균의 검정 다) 배양재료의 살균 - 락스 - Ca(ClO), NaOCl, HgCl2, EtOH(95, 70%)

다. 대량증식 단계 1. 부정아 및 액아형성 2. 생장조절물질과 형태형성과의 관계 3. 계대배양 횟수 4. 증식체계- 유전변이적고, 번식률이 높으며, 노동력절감 및 작업능력 극대화

Teak Micropropagation

Virginia pine Micropropagation

Taxus Micropropagation

Transgenic corn *GMO: Genetically Modified Organism