슈퍼제네릭 DDS 기반기술 개발사업 5세부: 안정화 분야 DDS 기반기술 구축 연구책임자: 김 용 희 주관기관: 한양대학교 생명공학전공

5세부 참여 구성원

1차년도 목표의 달성도

세부 연구내용 – 저분자 합성약물 안정화 제제 기술 개발 연구배경 □ 현재, 저분자량 약물에 대한 안정성에 대한 연구는 다음과 같은 목적에 국한되어 있음. 1) 다양한 환경적 요인(온도, 습도, 빛 등)의 영향에 대한 drug substances and products의 quality 변화 연구 2) Drug substances 의 re-test period 선정을 위한 연구 3) Drug product의 shelf life 선정을 위한 연구 및 적합한 보관조건 선정을 위한 연구 □ 이는, 환자에게 약물의 동등한 quality, safety, efficacy 등을 확보하여 제공하는데 의의가 있음, 그러나, 약물의 전처리 및 분석 실험시 분해되는 부분에 대한 연구는 미흡한 상황임 □ 이러한 부분은 주로 약물의 chemical stability와 관련이 있고, 관련된 불안정성은 약물의 pharmacological effects의 변화로 이어져, potential이 충분한 약물임에도 불구하고 drug discovery 과정에서 탈락되는 경우가 발생함. 불안정한 약물을 안정화하여 치료적 유용성을 개선할 경우, 약물의 가치를 극대화할 수 있을 것으로 기대됨. Ex 1. Dehydration and epimerization of tetracycline, leading to formation of epianhydrotetracycline, known to be associated with Fanconi syndrome. Ex 2. (-) form of thalidomide 을 임신부에 투여시 teratogenicity and neuropathy 유발, (+) form 으로 투여가 추천되나, 이 경우에도 체내에서 (-) enantiomer 로 racemization 되어 morning sickness 유발.

세부 연구내용 – 저분자 합성약물 안정화 제제 기술 개발 화학적 분해 경로 및 회피전략 □ Hydrolysis - Ester 분해메커니즘 관련 약물 Ethylparaben, benzocaine, procaine, oxathiin carboxanilide, aspirin, atropine, scopolamine, methylphenidate, meperidine, hydrocortisone, methylprednisolone, succinylcholine, chlorphenesin, carmethizole 분해관련 주요인자 회피 전략 R1 또는 R2를 EDG 또는 bulky G. 으로 치환 (ex. Tetramethypyrazine의 ester bond에 PEG polymer를 연결) CD를 이용한 masking (ex. HP-β-CD를 이용하여 aspirin을 포접) R1 과 R2의 치환기 종류 □ Hydrolysis - Amide 분해메커니즘 관련 약물 acetaminophen, chloramphenicol, lincomycin, indomethacin, and sulfacetamide(SU계열), β-Lactam antibiotics 회피 전략 분해관련 주요인자 CD를 이용한 masking (ex. Camptothecin을 CD로 포접하여 lactone ring의 hydrolysis를 막음) Lyophilization 또는 non-aqueous vehicle 사용 R1 과 R2의 치환기 종류 (하지만 N 때문에 less electrophile, poorer leaving G. 이므로, ester bond보다는 덜 빈번함.)

세부 연구내용 – 저분자 합성약물 안정화 제제 기술 개발 화학적 분해 경로 및 회피전략 □ Isomerization 분해메커니즘 관련 약물 Cyclosporin A: N,O-Acyl rearrangement Amphotericin B: Trnas-cis isomerization tirilazad: Dienone-phenol rearrangement 회피 전략 분해관련 주요인자 Two fixed-ring을 붙여 non-isomerizable analog 로 대체 (ex. Tamoxife은 trans isomer 가 antiestrogenic 특성이며 cis isomer는 estrogen agonist이므로, 체내에서 cis 대사체가 형성되는 것을 막기 위해 치환체를 도입) Spontaneously isomerization □ Racemization 분해메커니즘 관련 약물 Pilocarpine Rolitetracycline 회피 전략 분해관련 주요인자 Liposome 으로 봉입 (ex. Chlorthalidone의 racemization 속도는 liposome 농도를 증가시키면 비례적으로 늦어짐) CD 를 이용하여 봉입 (ex. tropic acid alkaloids 의 racemization 속도는 CD를 이용하면 감소함) (단, a-cyclodextrin 제외) Spontaneously racemization in in vitro and/or in vivo situation

세부 연구내용 – 저분자 합성약물 안정화 제제 기술 개발 화학적 분해 경로 및 회피전략 □ Oxidation 분해메커니즘 관련 약물 Ascorbic acid, Catechols(methyl dopa), Polyunsatruated molecules(Vitamin A), prednisolone, spiradoline 회피 전략 항산화제의 이용 (ex. α -tocopherol 또는 butylated hydroxyanisole (BHA) 와 같은 항산화제를 이용하여 aqueous solution 에서의 lovastatin oxidation 을 막음) 산화가 잘 일어나는 기를 없애거나 다른 기로 치환 (ex. 당뇨병 치료제인 tolbutamide 의 aromatic methyl기를 chloro substituent 로 한 것이 chlorpropamide임) Heterocyclic ring 으로 대체 (ex. 페닐기 같은 Electron rich aromatic ring을 가진 화합물은 산화가 잘 일어나므로, 피리딘이나 피리미딘 같은 질소를 포함하는 heterocyclic ring 으로 대체) 분해관련 주요인자 Ground state에 있던 triplet oxygen 이 빛에 의해 reactive oxygen species(singlet oxygen)으로 excitation Sulfur atoms are becoming more common in new drug candidates

세부 연구내용 – 저분자 합성약물 안정화 제제 기술 개발 화학적 분해 경로 및 회피전략 □ Photodegradation 분해메커니즘 관련 약물 Chloroquine, primaquine fumagillin, phenothizaines (accompanied by oxidation) Nifedipine, reserpine (accompanied by dehydrogenation) Mefloquine, furosemide (following photoinduced degradation – hydrolysis) Oxidation of menadione is enhanced by light 분해관련 주요인자 회피 전략 Amber or low actinic vessels 이용 (ex. fluorescent light에 의한 sulfa drug 의 광분해를 막음) Oxygen absorbent(active carbon, iron powder 등) 이용 (ex. cianidanol 의 photooxidation 을 막음) Photodegradation is often accompanied by oxidation The number and the wavelength of incident photons affect the photodegradation rate of drugs.

세부 연구내용 – 저분자 합성약물 안정화 제제 기술 개발 화학적 분해 경로 및 회피전략 □ Dehydration and decarboxylation 분해메커니즘 관련 약물 Erythromycin: dehydration Prostaglandin E2: dehydration 4-aminosalicylic acid, etodolac: decarboxylation 분해관련 주요인자 회피 전략 Hydroxyl G. 을 다른 G. 으로 masking (ex. Erythromycin 의 reactive hydroxyl group을 methoxy 로 masking하여 clarithromycin으로 만듦) CD를 이용한 masking (ex. HP-β-CD를 이용하여 prostaglandin을 포접) CD 및 각종 부형제를 이용한 환경 개선 (ex. Gabapentin과 baclofen은 liquid dosage formulation으로 만들 때 intramolecular dehydration reaction이 일어남. 이를 CD와 부형제를 이용하여 개선) Hydroxyl group 노출 Carboxylic acid group 노출 다양한 화학적 분해경로에 대하여 주로 cyclodextrin 유도체를 이용하여 안정성을 증진시키고 있는 것으로 조사됨. 하지만 이 또한 유도체의 종류와 대상 약물에 따라 다양한 효과를 나타내고 있으므로, 약물의 구조와 물성에 따른 불안정성 상관관계 정립이 요구됨.

세부 연구내용 – 저분자 합성약물 안정화 제제 기술 개발 화학적 분해 경로 및 회피전략 □ in vitro release 실험 시 약물 분해에 대한 연구 Donor Compartment Franz diffusion cell: 특정 약물의 피부로의 국소 적용의 가능성을 확인하고자 할 때 이용하는 in vitro release 실험 기구 기존의 연구 또한 donor compartment 에 국한되어 있고, 피부 위에서 이행한 약물을 받아주는 receptor compartment 에 대한 연구는 미흡한 실정임. Receptor Compartment Franz diffusion cell  Phenothiazine, Predniosolone, Retinol과 같이 용해도와 안정성이 매우 낮은 약물의 경우, 약물 release 양상이 receptor fluid 조성에 따라 매우 큰 영향을 받음 Percentage of remaining retinol after exposure to light, nitrogen gas, and air

세부 연구내용 – 저분자 합성약물 안정화 제제 기술 개발 화학적 분해 경로 및 회피전략 □ in vitro release 실험 시 약물 분해에 대한 연구 현재 용해도가 낮은 약물에 대해 흔히 사용되는 receptor fluid 조성 및 그에 대한 용해도

세부 연구내용 – 저분자 합성약물 안정화 제제 기술 개발 화학적 분해 경로 및 회피전략 □ in vitro release 실험 시 약물 분해에 대한 연구 현재 용해도가 낮은 약물에 대해 흔히 사용되는 receptor fluid에 대한 안정성 평가 a) phenothiazine b) prednisolone c) retinol Stability issue of retinol in various vehicle (when the initial concentration of the drugs is saturated concentraton in each vehicle: -●- vehicle 1, -○- vehicle 2, -▼- vehicle 3, -△- vehicle 4, -■- vehicle 5, -□- vehicle 6, -◆- vehicle 7, -◇- vehicle 8, -▲- vehicle 9, -▽- vehicle 10) (n=5). 용해도와 안정성이 매우 낮은 약물의 in vitro release 실험시 이용될 수 있는 다양한 receptor fluid에 대해, 각 약물의 용해도와 안정성이 각각 다르게 나타났음. 이 때 사용되는 물질은 skin integrity에 영향을 주어 release 값이 over- or under-estimation 될 수 있으므로 조성의 최적화 연구가 필요함.

세부 연구내용 – 핵산약물 안정화 제제기술 개발 연구 목표 및 주요 착안점 - 핵산 의약품 중 siRNA의 개발에 필수적인 의약품 안정화 기술 및 DDS를 구축하는 것을 목표로 연구에 도입. 연구범위 및 연구수행 방법 - 자체적으로 선별한 NIK-siRNA를 간 표적 지향적으로 전달하기 위한 목적으로 간세포의 asialoglycoprotein receptor로의 표적전달효과가 있는 galactosyl sphingosine(GS)이 포함된 cationic liposome을 제조. - 개발된 cationic liposome의 간세포성 표적 지향 약물 전달 효과를 검증하기 위해 간암 동물 모델의 확립. - 확립한 간암 동물 모델에 cationic liposome으로 봉입한 siRNA를 투여, Cy5가 표지된 siRNA의 형광 정도를 관찰함으로서 개발한 siRNA DDS의 간 표적 지향성 효과를 확인. - 항암제 5-Fu를 siRNA와 병용 투여함으로서 시너지 치료 효과를 검증.

세부 연구내용 – 핵산약물 안정화 제제기술 개발 □ 연구수행 내용 및 결과 - 간암 조절 NIK 표적화 siRNA의 성공적인 선별. 핵산 의약품의 전달체로서 galactosyl sphingosine이 포함된 cationic liposome의 제형 연구 완성.

세부 연구내용 – 핵산약물 안정화 제제기술 개발 그림 Effect of siRNA/liposome weight ratio on particle size and zeta potential of siRNA in DC-Chol liposome (A) and siRNA in GS/DC-Chol liposome (B). siRNA and the liposome (weight ratio=0.02, 0.05 and 0.10) were mixed in PBS buffer and kept at room temperature for 10 min. Then the particle size and zeta potential were measured. Each value represents the mean±S.D. (n=3).

세부 연구내용 – 핵산약물 안정화 제제기술 개발 Cationic liposome의 표면을 galactosyl sphingosine로 개질함으로서 목표한 간세포 표적 지향성 효과를 in vitro 실험으로 확인.

세부 연구내용 – 핵산약물 안정화 제제기술 개발 그림 Cellular uptake of Cy5-labeled siRNA in Hep3B through liposome-mediated delivery. Hep3B cells were incubated with Cy5-labeled siRNA in DC-Chol liposome, GS/DC-Chol liposome or naked form. The cellular uptake of siRNA was observed under fluorescence microscopy (magnification 10X) (A). Flow histogram of transfected Hep3B cells was detected after exposure to Cy5-labeld siRNA in different formation (B). The positive fluorescence level was established by visual inspection of the histogram of cells non-transfected that less than 1% appeared in the positive region.

세부 연구내용 – 핵산약물 안정화 제제기술 개발 - Hep3B cell line을 이용한 NIK mRNA의 RT-PCR 실험 및 HBsAg 수치 확인 실험 결과 galactosyl sphingosine 함유 cationic liposome 약물 전달체가 핵산 의약품인 siRNA의 효능을 향상시킴을 검증. 그림 Detection of HBsAg level by enzyme-linked immunoassay kit (A) and NIK level by RT-PCR (B) in Hep3B cells. (a) PBS control; (b) scrambled siRNA; (c) empty GS/DC-Chol liposome; (d) siRNA encapsulated in the GS/DC-Chol liposome; (e) naked siRNA.

세부 연구내용 – 핵산약물 안정화 제제기술 개발 - 개발한 DDS의 효과를 다양한 실험을 통해 검증하고 임상적으로 잘 알려진 항암제 5-FU와의 병용투여를 통해 상승적 효과를 확인. 그림 Cell viability test of Hep3B. (a) control; (b) naked siRNA; (c) siRNA in GS/DC-Chol liposome; (d) 5-FU and siRNA encapsulated in the GS/DC-Chol liposome; (e) 5-FU; (f) scrambled siRNA; (g) GS/DC-Chol liposome. Cell viability assay (MTT assay) of Hep3B cells was performed after treatment of siRNA in various formation with or without 5-FU. Data represent a mean ± SD. ** p<0.01, * p<0.05.

세부 연구내용 – 핵산약물 안정화 제제기술 개발 그림 Apoptotic effects of 5-FU or NIK-specific siRNA in DC-Chol or GS/DC-Chol liposome. Hep3B cells were treated with NIK-specific siRNA in naked form or DC-Chol or GS/DC-Chol liposome, with or without 5-FU (A). The apoptotic populations of the cells were analyzed by a flow cytometry method. Giemsa staining was performed to observe morphological feature of apoptosis such as cell condensation or shrinkage (B).

세부 연구내용 – 핵산약물 안정화 제제기술 개발 - 면역능력이 억제된 누드마우스를 이용하여 간암 동물 모델을 확립하고, 구축된 동물 모델 내부에서 표적 장기인 간세포로의 약물 전달능 검증. 그림 Hep3B xenograft model. The animal tumor model was generated by subcutaneous injection of Hep3B (5x106 cells) into a flank region on the male nude mice (BALBc nu/nu). The volume of the Hep3B xenograft reach 100mm3. 그림 Biodistribution of Cy5-labeled siRNA in Hep3B tumor bearing mice. The siRNA was fluorescently labeled with Cy5. Naked siRNA and siRNA in GS/DC-Chol liposome were administered to Hep3B tumor-bearing mice at a dose of 3 mg/kg. At 24 hr post-injection, the amount of the Cy5-labeled siRNA in different tissues was determined as described in the materials and methods section and expressed as an initial dose per gram tissue (% ID/g). Data represent a means±SD (n=3/group). **P<0.01 ,*p<0.05, as compared to naked siRNA.

세부 연구내용 – 핵산약물 안정화 제제기술 개발 그림 Biodistribution of Cy5-labeled siRNA in Hep3B tumor bearing mice. The siRNA was fluorescently labeled with Cy5. Naked siRNA and siRNA in GS/DC-Chol liposome were administered to Hep3B tumor-bearing mice at a dose of 3 mg/kg. At 24 hr post-injection, the amount of the Cy5-labeled siRNA in different tissues was determined as described in the materials and methods section and expressed as an initial dose per gram tissue (% ID/g). Data represent a means±SD (n=3/group). **P<0.01 ,*p<0.05, as compared to naked siRNA. - 생체 내에서 불안정한 핵산 의약품으로서의 siRNA의 단점을 cationic liposome 시스템으로 극복, 간세포 특이적으로 전달함. 이에 따라서 핵산 의약품의 효율성을 극대화시키고 동시에 기존 항암제의 내성을 감소시킴으로 암 치료의 새로운 대안을 제시.

세부 연구내용 – 저분자 합성약물 저장 안정화 제제 기술 개발 - 핵산의약품 안정화를 위한 양이온성 합성고분자-천연물질 접합체 합성 - 핵산분해효소 (DNAase I) 존재 시 완충용액 내에서의 plasmid DNA 안정성 향상 확인 - 해당 합성고분자의 유도체들을 합성하고, plasmid DNA의 안정성확보와 고분자/핵산 복합체의 물리화학적 성질을 규명하는 연구가 진행 중에 있음

세부 연구내용 – 저분자 합성약물 저장 안정화 제제 기술 개발 - 올리고핵산의약품 (siRNA, antisense oligonucleptide)의 안정화를 위한 PEGylation 기술 검증을 위해 siRNA에 PEG를 접합시킨 접합체를 합성함 - PEGylation된 siRNA는 혈청존재 하에서 un-modified siRNA에 비해 안정성이 크게 향상된 것을 관찰 할 수 있었음. siRNA siRNA-PEG 1 2 4 8 16 24 48 Time (h)

세부 연구내용 – 단백질 약물 안정화 제제 기술 개발 control DB(old) DB(new) PTD-protein(old) + CoCl2 PTD-protein(new) Dialysis buffer 전 Dialysis buffer 후 1X PBS, 20% glycerol, 1% Triton-X, 5mM EDTA, 100mM KCl, 20mM Hepes, Autoclaved H2O, 1mM PMSF 1X PBS, 20% glycerol FPLC buffer 전 FPLC buffer 후 Washing buffer 1 - 5mM Imidazol Washing buffer 2 - 20mM imidazol Elution buffer - 250mM imidazol 무독성 융합단백질의 치료효과의 변화 관찰. (융합단백질의 사용량 대비 치료효율 ↑)

Schematic structure of PTD protein 세부 연구내용 – 단백질 약물 안정화 제제 기술 개발 Schematic structure of PTD protein Long spacer Old formulation 6x His PTD Protein New formulation PTD Protein 6x His Remove the long spacer Old formulation New formulation

세부 연구내용 – 단백질 약물 안정화 제제 기술 개발 융합단백질 생산 프로토콜 확립 PTD Protein 6x His 불필요한 spacer 제거 융합단백질의 독성 최소화 및 활성 극대회 FPLC buffer 최적화 융합단백질의 효율적인 정제 높은 농도의 단백질 분리 생산된 융합단백질의 저장 융합단백질의 고유 기능 및 안정성 유지

연구실적 게재연도 논문명 저자 학술지명 Vol.(No.) 국내외 구분 SCI 구분 2010.08 Preparation and Functional Analysis of Recombinant Protein Transduction Domain-Metallothionein Fusion Protein K.S.Lim Y.W.Won, Y.S. Park Y-H.Kim Biochimie 92.(964-970) 국외 SCI (IF 3.7) Characterization and in vitro evaluation of freeze-dried microparticles composed of granisetron–cyclodextrin complex and carboxymethylcellulose for intranasal delivery H.J Cho P. Balakrishnan W.S Shin S.J.Chung C.K.Shim D.D.Kim International Journal of Pharmaceutics 400.(59-95) (IF 2.9) 2010.09 Biodistribution and Improved Anticancer Effect of NIK-siRNA in combination with 5-FU for Hepatocellular Carcinoma J.S.Kim S.S.Kang H.A.Cho Archives of Pharmacal Research Accepted (IF 1.15)