Yeast two- hybrid system 을 활용한 Mycobacterium smegmatis 의 일산화탄소 산화관련 유사 유전자와 상호작용하는 단백질 분석 이정은

연구 배경과 목적 Mycobacterium smegmatis 호기적 조건하에서 일산화탄소(CO)를 유일한 에너지 및 탄소원으로 이용하여 성장할 수 있는 carboxydobacteria CO를 산화하는데 필수적인 효소인 CO dehydrogenase (CO-DH) 존재함 CO-DH는 물을 산화제로 이용하여 CO를 CO2 로 산화시키는 주 효소 CO + H2O ---------- CO2 + 2H + 2e Carboxydobacteria에서 CO-DH 유전자 주변에 기능이 알려지지 않은 orf들이 conserve 되어 있다. CO-DH 유전자 주변에 이러한 orf들이 conserve 되어 있음을 보고 판단할 때 이들 orf들이 CO-DH와 관련되어 있을것이라 추정되므로 이들 orf가 CO-DH와 interacting 하는지 또는 이들 orf들 끼리 interaction하는지 알아보고자 하였다 또한 이들 Orf와 interating 하는 다른 protein이 있는지 알아보기로 한다. CO-DH + -

cutR cutB cutC cutA orf2 orf3 orf4 orf5 Copy 1 Mycobacterium sp. strainJC1 orf1 cutB cutC cutA orf2 orf3 orf4 orf5 orf6 Copy 2 M. tuberculosis M. smegmatis M. bovis M. marinum M. leprae 17.5 kb Oligotropha carboxidovorans Hydrogenophaga pseudoflava Pseudomonas thermocarboxydovorans Arthrobacter sp. FB24

Yeast two-hybrid system 이미 알고 있는 두 단백질 간의 상호작용을 확인하고자 할 경우나, 이미 알고 있는 단백질과 상호 작용하는 또 다른 단백질을 스크리닝 하고자 할 때 사용할 수 있다. Regulator 들은 특정 염기 서열로 이루어진 promtor부위와 결합하는 DNA- binding domain과 RNA polymerase II 복합체와 직접적으로 작용하여 transformation에 관여하는 기능을 수행하는 activation domai 으로 구성되어 있다. Recombinant DNA technology 로 분리된 DNA- binding domain 과activation domain은 상호작용이 가능한 단백질을 각각의 domain의 유 전자에 결합시켜 yeast에 발현 시키면 두 단백질에의 상호작용에 의해 두 domain이 transcription과 관련된 기능을 하게 됨으로써 유전자 발현이 가능해짐.

연구 방법 1.Yeast two-hybrid system을 위한 plasmid 제작 1) bait vector 제작 2) prey vector 제작 2.Yeast transformation

Bait vector 제작 Orf5 or Orf6가 만들어지도록 primer 제작 Orf5 F: 5’ GAA TTC ATG AAG ATC GCG AAC GAG TTC ACT G 3’ R: 5’ GGA TCC TCA TCT GCC GCG AAG GGC CT 3’ Orf 6 F: 5’ GAA TTC ATG ACC GCA CCG CTG CTG CT 3’ R: 5’ GGA TCC CTA AGC CCC GAG CAC GTC GA 3’ Orf 5 / Orf 6 PCR 수행 Template(Msm genomic DNA) 1 ㎕ Prrimer(F, R) 1 ㎕씩 Ex taq 0.5 ㎕ dNTP 4 ㎕ 10 X Ex taq buffer 2 ㎕ D.W 11.5 ㎕ 1 2 1 2 3 Lane 1: 1kb ladder Lane 2 :Orf5의 PCR product from ch’mal DNA of M. smegatis Lane 1 : 1kb ladder Lane 2,3 :Orf6의 PCR product from ch’mal DNA of M. smegatis Orf5 PCR product (700 bp) Orf6 PCR product (1194 bp)

Bait vector 제작 Sequencing the cloned pGEM-T easy vector containing PCR product Ligate with cloned PCR product with pAS2-1 for bait vector

Bait vector 제작 Orf5 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut 1 2 3 4 5 Lane1,2,3,4 : pAS2-1 with orf5 를 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut Lane5 : 1kb ladder Orf5 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut Vector size: 8392 bp Insert size(orf5 ):700 bp Orf6 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut Vector size: 8392 bp Insert size(orf6 ):1194 bp

Prey vector 제작 Orf5 or Orf6가 만들어지도록 primer 제작 Orf 5 F: 5’ GGA TCC GAT GAA GAT CGC GAA CGA CTT 3’ R: 5’ GAA TTC CTA TCA TCT GCC GCG AAG GGC CT 3’ Orf 6 F: 5’ GAA TTC CTA AGC CCC GAG CAC GTC GAA CAA 3’ R: 5’ GGA TCC GAT GAC CGC ACC GCT GCT GCT3’ Orf 5 / Orf 6 PCR 수행 Template(Msm genomic DNA) 1 ㎕ Prrimer(F, R) 1 ㎕씩 Ex taq 0.5 ㎕ dNTP 4 ㎕ 10 X Ex taq buffer 2 ㎕ D.W 11.5 ㎕ 1 2 3 4 1 2 3 4 5 Lane 1: 1kb ladder Lane 2,3,4 :Orf5의 PCR product from ch’mal DNA of M. smegatis Lane1,2,3,4 :Orf6의 PCR product from ch’mal DNA of M. smegatis Lane 5 : 1kb ladder Orf5 PCR product (700 bp) Orf6PCR product (1194 bp)

Prey vector 제작 Sequencing the cloned pGEM-T easy vector containing PCR product Ligate with cloned PCR product with pGAD GH for prey vector

Prey vector 제작 Orf5 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut 1 2 3 4 5 Lane1 : 1kb ladder Lane,2,3,4,5 : pGAD GH with orf5 를 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut Orf5 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut Vector size: 8009 bp Insert size(orf5 ):700 bp 1 2 3 4 5 Lane1 : 1kb ladder Lane,2,3,4,5 : pGAD GH with orf6 를 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut Orf6 BamHI/EcoRI 으로 restriction enzyme cut Vector size: 8009 bp Insert size(orf6 ):1194 bp

Yeast transformation 1. Inoculate yeast colony into 1 ml of YPD 2. 30℃,250 rpm에서 2~3 일 정도 키운다. 3. 키운 yeast (1 ml)을 50 ml of YPD에 옮긴다. 4. 다시 30℃, 250 rpm에서16~18시간 정도 키운다. 5. 잘 키운 yeast (30 ml) 를 300 ml 의 YPD에 옮긴다. 6. 다시 30℃, 230~270 rpm에서 3시간 정도 키운다. 7. 1000 x g, 25℃, 5 min centrifuge 8.40 ml의 증류수 또는 TE에 resuspend

Yeast transformation 9. 1000 x g, 25℃, 5 min centrifuge 10. 1.5 ml의 1x TE/1x LiAc에 resuspend 11. 0.1 ㎍ of plasmid DNA (co- transformation일 경우, 각각 0.1 ㎍)와 0.1 ㎎ of herring sperm DNA 를 새 1.5 ml tube에 넣는다. 12. 0.1 ml의 yeast competent cell을 넣고 잘 섞는다. 13. 0.6 ml의 PEG / LiAc 용액을 넣고 10초간 vortex 14. 30℃, 200 rpm에서 30분간 배양한다. 15. 70 ㎕의 DMSO를 넣고, 위 아래로 5회 뒤집어 섞는다.

Yeast transformation 16. 42℃, 15분간 heat shock. 17. 얼음에 1-2 분간 방치 18. 14,000 rpm 으로 5초간 원심 분리 후, 상층액을 버린다 19. 0.5 ml의 TE에 resuspend. 20. 100 ㎕ 씩 SD+ DO 배지에 spreading ( DO: -Trp, -Leu,-His,-Ade /- Trp, -Leu)

앞으로의 실험 계획 제작되어 있는 orf  들의 bait vector와 prey vector를 이용하여 이들 Orf들 어떤 상호작용이 있는지 확인한다. 알고 있는 protein과 상호 작용하는 unknown protein 어떤 protein인지 알아 보기 위해 Mycobacterium smegmatis 의 cDNA library를 제작한다. 이런 protein이 발현 될 수 있는 express vector(prey vector)를 만든다. Yeast two-hybrid 방법을 이용하여 CO-DH 유전자 주변에 conserve 되어 있는 orf들과 interaction하는 unknown protein을 스크리닝한다.