National Cancer Center Research Institute Apoptosis induction and enhancement of cytotoxicity of anticancer drugs by a lipid analogue Soo-Jeong Lim, Ph.D. National Cancer Center Research Institute

Chemosensitizer의 개념과 조건 Chemosensitizer란 저용량으로 기존의 항암제의 항암효과를 synergistic하게 증진시킬 수 있는 치료 보조제의 개념임. Chemosensitizer의 병용에 의해 기존 항암제의 투여량 조절이 가능 이때 항암제의 therapeutic index를 증진시키기 위해서는 암세포에의 항암 효과는 증진시키면서도 정상세포에는 상대적으로 영향을 덜 미치는 chemosensitizer가 이상적임 연구 및 개발의 역사는 장구하나 괄목할 만한 결과는 미미함. 생체내 환경은 실험실 적 조건과 매우 다름-용해도, 체내 안정성 및 암부위로의 이행 등의 문제가 연구 초기 단계에서부터 고려되지 않았기 때문 연구 초기 부터 Delivery/stability등의 실제적인 문제를 고려한 chemosensitizer의 설계가 필요함.

Blood circulation에 유입된 항암제 분자들의 일반적 체내 분포 양상 정상조직 암조직 약물농도 Normal tissue Tumor Renal excretion

항암제를 단분자로 투여하는 것보다 10-100 nm로 크기를 증대 시켜 투여하면, tumor tissue로의 항암제의 이행이 증진된다. (Enhanced Permeability and Retention Effect) (Maeda, 1989) 정상조직 암조직 약물농도 Normal tissue Tumor Renal excretion

Chemosensitizer에 EPR effect의 개념을 도입하려면? -크기를 증대시켜야 ! 1. 다른 고분자 물질과 공유결합체를 만든다. 2. 나노크기의 입자의 내부에 chemosensitizer를 봉입시킨다. 실제적 적용 가능성이 고려되어야 !

EPR effect를 기대할 수 있으면서도, 실용화 가능성이 높은 chemosensitizer의 조건 입자 막 구성성분 이 될 수 있는 물질 친수성 물질 수상 100 nm Liposome, micelle과 같은 입자의 막구성 성분이 될 수 있는 양친성 (amphiphilic) 지질 중 chemosensitizing activity가 있는 지질을 발굴한다면 …. Trash

Lipid-based chemosensitizer의 입자 구조화에 의해서 기대되는 장점들 EPR effect 외에, - Chemosensitizer의 안정도 증가 Chemosensitzer의 용해도 개선 Chemosensitizer의 체내 거동을 바람직한 방향으로 조정 가능 (ex : Prolongation of blood circulation time by addition of PEG-modified lipid as another component of particle) - 비어 있는 내부에 항암제를 봉입하여 co-delivery할 여지가 있음. PEG

Lipid-based chemosensitizer 후보 물질 선정의 기준 Pharmacologically acceptable molecule이면서도 암세포 (in vitro & in vivo)에서 고농도에서는 growth inhibition시키는 것으로 이미 보고된 바 있는 lipid Classical ‘intrinsic’ apoptotic pathway외의 death pathway (‘extrinsic’ apoptotic pathway 또는 caspase-independent apoptosis)를 activation시킬 수 있는 lipid Apoptosis inducer lysosome Death receptor ‘Intrinsic’ ER ? Calpain, granzyme Cathepsin, ….. Caspase 8 mitochondria ‘Caspase-independent’ ‘Extrinsic’ Caspase 9 Effector caspase (3, 7) Apoptosis

Cadidate as a lipid-based chemosensitizer: a-tocopheryl succinate 선정의 배경 막성분 ? 항산화작용에 관한 연구에서 리포좀 등의 입자의 막구성 성분으로 이용된 바 있는 a-tocopherol (vitamin E) 에 친수성 기가 보충된 유도체임. 암세포 성장억제 유도? 암세포에서 보다 더 강력한 세포 독성을 보이며, 이는 apoptosis 유도에 의함 (Neuzil, 2001, faseb). PSA를 downregulation 시킴 (Zhang., 2002, PNAS). 실험 동물 모델에서도 단독으로 또는 TRAIL과의 병용에 의해 항암활성을 보임( Weber, 2002, Clin. Cancer Res 등) Apoptotic pathway ? 많은 설이 있음 (Intrinsic & extrinsic & caspase-independent) 항암 활성을 나타내는 기전 명확히 알려져 있지는 않으나, TGF-b, FAS signal 등의 induction, p21waf/cip1 과 같은 cell cycle 관련 인자를 조절하거나 AP-1-controlled gene들의 발현 조절 등에 의함. 최근, TOS가 세포내에서 활성화산소 (ROS)를 발생시킴이 보고됨 ( Weber, Biochemistry, 2003) 그러나, vitamin E 유도체류는 대개 항산화제로 알려져있음. TOS의 경우에도, normal hepatocytes를 이용한 study에서는 비슷한 농도 범위에서 반대로 항산화제의 역할을 하는 것으로 보고됨 Question : 과연 ROS가 TOS가 암세포에서 apoptosis를 유발하는 데 있어서 중요한 역할을 하는가?

Growth inhibition and apoptosis induction by TOS Proliferation TOS ( m M) 40 80 120 160 200 20 60 100 140 TOS- TOS+ H460 A549 SNU466 T98G U87MG Viability (% of untreated cells) 50 40 Cell death (%) 30 Apoptotic cells(%) 20 10 TOA TOA +SA TOS Mitocondria membrane potential Control 100 mM TOS 200 mM TOS CCCP M1=76.6% M1=78.6% M1=48.5% M1=19.0% U87MG M1 M1 M1 M1 M1

ROS generation by TOS in TOS-sensitive A549 cells Counts 100 101 102 103 104 Control TOS H2O2 DCF 20 80 60 40 40 40 peroxide TOS 30 30 ROS (fold indcution) 20 ROS (fold induction) 20 superoxide 10 10 TOA SA TOA+SA 5 10 15 20 Dose (mM) 0 40 60 80 80 80 80 Time (h)

ROS generation by TOS in various cancer cell lines The ROS generation upon treatment with TOS seems to be an important factor determining the susceptibility of cells to TOS ROS generation by TOS in various cancer cell lines 40 80 120 160 IC50 (mM) 16 12 With 40 mM of TOS With H2O2 8 ROS (fold induction) 4 A549 H460 SNU466 T98G U87MG

Role of ROS in TOS-induced apoptosis TOS induces apoptosis ROS-dependently or –independently depending on cell types Role of ROS in TOS-induced apoptosis 20 With IC50 and IC80 of TOS 16 12 ROS (fold induction) 8 4 A549 H460 SNU466 T98G U87MG 40 16 TOS TOS + NAC 12 TOS 30 TOS + NAC ROS (fold induction) Cell death (%) 8 20 4 10 A549 H460 T98G A549 H460 T98G

TOS induces caspase activation in cancer cells regardless of their ROS-dependency. Excessive ROS generation은 흔히 caspase-independent apoptosis로 이어짐. 여기서는? H460 T98G Procaspase-3 B-actin 5 5 Caspase activity (fold) 4 4 3 3 2 2 1 1 TOS (mM) 40 60 0 100 150 TOS (mM) TOS (mM) TOS (mM) 0 25 40 0 40 50 60 80 0 40 100 150 116 kDa PARP cleaved PARP -actin H460 SNU466 T98G

TOS-induced cell death is mediated by both caspase- T98G PARP -actin Cleaved PARP TOS Z-VAD-FMK – + Cell death (%) 5 10 15 20 25 30 Control Z-vad-fmk TOS + TOS Z-vad-fmk + TRAIL TRAIL TOS-induced cell death is mediated by both caspase- dependent and -independent apoptosis in ROS-dependent cells, while being mediated by caspase-dependent apoptosis in ROS-independent cells.

TOS-induced ROS generation and caspase activation are not related to each other The role of ROS in TOS-induced caspase activation CTL TOS NAC N+T ROS (fold induction) 2 4 6 8 control TOS Z-vad-fmk +TOS Procaspase 3 PARP Cleaved PARP -actin ROS Caspase TOS Apoptosis ROS ? TOS Apoptosis Caspase ROS Caspase TOS Apoptosis

a-tocopheryl succinate Growth inhibition (%) 80 40 –O C (H3C) O (CH2CH2O)nH CH3 H3C H a-tocopherol a-tocopheryl acetate 124 nm <100 nm a-tocopheryl succinate a-tocopheryl polyethylene glycol 1000-succinate

Chemosensitization effect of TOS MRP1 MDR gene에 의해 발현되는 P-glycoprotein과 함께, ATP-binding cassette transporter superfamily의 주요 멤버로, drug efflux pump의 역할을 하여 과발현시 drug resistance의 원인이 됨 Glutathione (GSH) - MRP function에 관여 : Drug이 MRP에 의해 transport되기 위해서는 GSH가 필요 (drug-GSH conjugate가 되거나 co-transport 됨). (Zaman, PNAS, 1995). - Oxidative stress에 관한 cellular defence system의 구성원 : 세포에서 anticancer drugs에 의한 ROS generation에 resistance를 줌. - Glioblastoma와 같이 cellular GSH level이 높은 경우, GSH level을 감소시키면 1) MRP 관련 drug이면서 2) ROS generation에 의해 세포 사멸을 유발하는 약물에 대한 response를 개선 됨. - 그런데 TOS가 GSH level을 낮춘다고 보고됨 (Biochemistry, 2003) Question : TOS가 GSH level을 조절함에 의해서 MRP-overexpressing glioblastoma cell에서 MRP관련 drug 에 대한 response를 증가시킬 수 있는가?

Effect of TOS on the GSH level of glioblastoma cells (A) TOS (B) BSO 6 6 0 h 5 5 16 h 24 h 4 4 GSH (nmole)/mg of protein 3 3 2 2 1 1 T98G U87MG T98G TOS lowered the intracellular concentration of GSH in glioma cells, to a similar extent with DL-buthione (S, R)-sulfoximine (BSO), a GSH synthesis inhibitor.

(Relative Fluorescence) MRP functional assay in MRP-overexpressing T98G cells 5 4 (Relative Fluorescence) Fluorescein uptake 3 2 1 0 50 100 150 100 200 200 BSO (mM) IND (mM) TOS (mM) TOS increased the uptake of fluorescein, a MRP-specific substrate into MRP-overexpressing T98G cells, in a dose-dependent manner.

Correlation of MRP-expression and etoposide sensitivity in glioblastoma cells U87MG U251MG T98G SNU489 MRP MDR G6PDH (B)

Effect of TOS on the uptake of etoposide MRP-overexpressing T98G cells 4 3 Uptake of etoposide (mg/mg of protein) 2 1 Pretreatment - 75 150 200 TOS BSO

Effect of TOS on the etoposide sensitivity in glioblastoma cells Dose-growth curve Combination index T98G 4 10 mM 40 mM 3 2 1 Growth and viability (% of untreated cells) Combination Index T98G SNU489 0.1mM 4 U87MG 0.4 mM 3 2 TOS - TOS + 1 U87MG U251MG

Was coorperative ROS generation also made by co-treatment of etoposide with TOS? T98G U87MG 8 8 6 Etoposide 6 4 4 2 2 TOS - TOS + TOS - TOS + Our data strongly suggest that TOS enhance the etoposide sensitivity in MRP-overexpressing cells by lowering GSH level.

Acknowledgement 국립암센터 연구소 강영화 이은명 최문경 육희정 이현장 강릉대학교 치과대학 김소희 그밖의 많은 분들…

THANK YOU FOR ATTENTION!