유전자 발현 분석 (Analysis of Gene Expression ) 3주간 실험

실험일정 1주차 Total RNA Isolation 2주차 cDNA synthesis (Reverse transcription) 3주차 qRT-PCR  qRT-PCR  specific primer  ACTIN (internal standard)  qRT-PCR Data 분석하기

실험일정 1주차 1주차 RNA Isolation Growth condition FDM medium (fusarium defined medium) 50ml or NSM medium (Nash and Syyder medium) 50ml at 25℃, 120rpm for 3days 유전자 : cyclic peptide synthase (CPS)

Theory : RNA Isolation QIAshredder Replaces syringe-and-needle homogenization sample material의 손실 최소화. 샘플간에 cross-contaminzation최소화 insoluble debris가 filter 를 통과하지 못하도록 하여 viscosity를 감소 RNeasy column Silica membrane Technology를 이용하여 200nt이상의 RNA를 선택적으로 분리 정제 200nt이하의 Small RNA가 선택적으로 제거 (Total RNA 내에 mRNA양이 높아진다.) Column방식을 이용하기 때문에 순도가 높은 RNA가 얻어진다.

주의 사항  RNA 는 안정된 물질인 DNA 와 달리 매우 약하고 불안정 한 물질이다.  RNA 분해효소인 RNase는 멸균이나 높은 pH로 파괴되지 않는다.  RNase는 대부분의 세포가 환경 가운데로 분비하기 때문에 침, 땀등에 매우 많이 존재함. 따라서 1) 맨 손으로 시약이나 샘플을 만지지 말 것 2) 타액이나 땀이 시약이나 샘플을 오염시키지 않도록 주의  모든 기구를 멸균, 모든 재료를 멸균 혹은 DEPC 처리 해야 함  수용액에 녹은 상태에서 degradation이 빠르게 진행

Method I : RNA extraction Total RNA was isolated using Plant total RNA isolation kit

Method II : RNA extraction Before Starting: 1.) RLT bf. (lysis bf.)1ml 당 B-Mercaptoethanol 10ul를 첨가 한 후 사용한다. (RLT bf.는 필요한 양만큼 덜어서 사용하는 것이 좋다.) 2.)100% Ethanol 44ml을 RPE bf.(washing bf.)에 첨가한 후 사용한다. 첨가 시 buffer이름, Column의 종류를 혼동하지 않도록 주의!!

Method III : RNA extraction 1.) 잘 자란 cell을 50ml tube에 한 데 모아, centrifuge를 이용해 다운시 킨 후, 상등액을 버려, compact한 pellet을 형성시킨다. 2.) cell pellet에 1200ul의 RLT bf.를 첨가해 준다. (containing B-Me) 3.) Vortexing을 통해 pellet을 완전히 resuspend 시켜준다. 4.) 1200ul의 lysate (cell+RLT bf.)를 두 개의 QiaShredder column (보라색)에 나누어 담아준다. (각 column은 600ul의 lysate를 포함.) 5.) 13000rpm에서 2min동안 centrifuge를 진행 한다. 6.) column에서 걸러진 600ul의 lysate에 600ul의 70% Ethanol을 첨가 한 후 pipet을 이용하여 잘 섞어 준다.

7.) 샘플(lysate 600ul+70% EtOH 600ul) 중 600ul를 pipet을 이용해 RNeasy mini columns(분홍색)으로 옮겨준다. 8.) Centrifuge at 11,000rpm for 30 seconds. flow through는 버린다. 9.) 남은 샘플 600ul도 마저 RNeasy mini columns으로 옮긴다. 10.) 11,000rpm에서 30 sec동안 centrifuge 후 flow through는 버린다. 11.) Add 700ul of Buffer RW1 to the columns. 12.) 11,000rpm에서 30 sec동안 centrifuge 후 flow through는 버린다. 13.) RNeasy min column(membrane 포함 부분)을 새 2mL collection tubes로 옮겨준다.

14.) RPE bf. 500ul를 첨가해준다. 15.) 11,000rpm에서 30 sec동안 centrifuge 후 flow through는 버린다. 16.) 14), 15), 과정을 반복해준다. (두 번의 Washing 과정.) 17.) 11,000rpm에서 2min 동안 centrifuge 후 flow through는 버린다. (column의 membrane부위에서 EtOH을 완전히 날려준다.) 18.) RNeasy column을 새 1.5mL tubes로 옮겨준다. 19.) RNase free water(Elution bf.) 50ul을 column의 membrane부분에 잘 첨가해준다. 20.) 11,000rpm에서 1min 동안 centrifuge 해준다.

실험일정 2주차 2주차 cDNA synthesis Isolated Total RNA를 template로 하여, Reverse transcription을 통해 cDNA을 합성해 내는 과정.

Theory I : cDNA synthesis Q1. DNA를 직접 extraction하지 않고, RNA로 부터 cDNA를 합성해 내는 이유는? Q2. oligo(dT)primer는 RNA의 어떤 특징을 이용해 primer로 작용하여reverse transcription을 시작할 수 있는가? 전사 후 RNA 가공과정 ① 5' G capping ② 3' poly-A tailing ③ RNA splicing

Theory II : cDNA synthesis

Total RNA 양 정량 하기 RNA Quantification 1. Dilute 1 μl RNA into final 100 μl H2O. 2. O.D. measurement (spec. 으로 양 측정) 3. O.D.260 X 40 X dilution factor is μg/ml RNA. X μg/ml = O.D.260 X 40 X 100  cDNA 합성 시 동량의 RNA를 template로 써 주어야 한다.

Method I : cDNA synthesis Before Starting: 1) Total RNA extract 2) Oligo (dT)-primer 3) Reverse transcriptase 4) rxn. Buffer 5) RNase free water 주의사항 소량의 샘플, bf, enzyme을 다루는 실험이니 pipet을 사용시 팁 끝이나, 바깥쪽에 묻어있어 mixture에 섞이지 않을 수 있으므로 주의.

Method II : cDNA synthesis 1.) RNA extract와 각종 bf, enzyme 들을 얼음과 함께 준비한다. 2.) RNA extract를 gDNA로 부터 오염되는 것을 막기 위한 반응을 진 행 한다. gDNA wipeout bf. (7X) 2μl Template RNA 1ug Rnase-free water up to 14ul 3.) 42℃에서 2분간 반응시킨 후, 바로 얼음에 옮겨준다. 4.) template가 준비 되었으니, Reverse-transcription을 위한 반응을 준비한다.

Template RNA (gDNA eliminated) 14μl RT bf. (5X) 4μl RT primer 1μl Reverse transcriptase 1μl Total volume  20μl 5.) Master mix를 만들어 다음과 같은 반응을 진행시킨다. 6.) 42℃에서 15분 동안 반응 시킨다. 7.) 95℃에서 3분간 반응 시켜, reverse transcriptase의 역할을 비활성화 시킨다. 8.) 합성된 cDNA를 냉동보관 하여준다. Master Mix. = 6 μl

실험일정 3주차 2주차 qRT-PCR & Data 분석하기 cDNA를 template로 하여, target gene(cyclic peptide synthase (CPS))에 대한 specific한 primer와 conserve하게 발현되는 internal standard(ACTIN)에 대한 primer를 이용하여 qRT-PCR을 진행. internal standard의 발현량과 비교해, target gene 의 transcript level을 분석한다.

Theory I : qRT-PCR Internal Standard :그 양을 알고 있는 compound. 여기에서는 그 발현 량이 일정하고, 잘 알려진 conserve된 유전자을 의미한다. qRT-PCR에 의해 target 유전자의 발현 량을 정량분석을 하는 경우, 일정량의 발현 량을 가진 internal standard와 비교, 분석을 통해 얻어진 값을 이용하여 Target 유전자의 발현 량을 얻어낼 수 있다. 대표적으로 Actin, Tubulin과 같은 유전자들이 쓰인다.

Theory II : qRT-PCR SYBR green signal detection DATA 분석 Transcript 신장, 증폭

Method I : qRT-PCR Before Starting: 1) cDNA 2) primer  CPS specific primer  ACTIN specific primer 3) SYBR mixture + D.W 주의사항 소량의 샘플, bf, enzyme을 다루는 실험이니 pipet을 사용 시 팁 끝이나, 바깥쪽에 묻어있어 mixture에 섞이지 않을 수 있으므로 주의.

Method II : qRT-PCR Reaction Mixture qRT-PCR condition cDNA 1 μl SYBR mix. 10 μl P1 + P2 2 μl 3rd D.W 7 μl Total volume 20 μl Hold Tem. : 95℃ time : 15min Cycling 95 ℃ for 10secs 60 ℃ for 15secs 72 ℃ for 20secs This cycles repeats for 45 times

DATA 분석하기 금요일 3시~6시, 월요일 3시~5시 사이 각 조 별로 시간을 맞추어 오세요. 미리 시간을 정해 조교에게 알려주세요.