2nd Class Sub Cloning 2013-2학기 생화학실험(2) 담당교수 : 송재환 교수님 담당조교 : 이해경 CONTENTS Recombinant DNA In vitro recombination Restriction enzyme Agarose gel electrophoresis DNA elution from agarose gel Ligation 담당교수 : 송재환 교수님 담당조교 : 이해경

What is recombinant DNA ?? Recombination DNA What is recombinant DNA ?? Recombinant DNA ; 두 개 이상의 source에서 유래한 DNA가 결합된 artificial strand of DNA. the basis for all sorts of genetic engineering. Recombinant DNA for biologists? 유전자재조합 농작물 연구용 유전자변형 생물체 (Genetically modified animals for research ex. Oncomouse) Genetically modified microorganisms to produce pharmaceuticals (insulin) Gene therapy (Cystic Fibrosis) To isolate and study a particular gene (subcloning) Creating transgenic or organisms or chimeras

Recombination DNA

In vitro recombination http://www.gene.com/AE/AB/GG/plasmid.html 1 1. Insert와 vector를 동일한 Restriction enzyme을 이용하여 자른다. (잘린 부분은 서로 complimentary single stranded sections을 가짐.) 2. Complimentary sticky ends Pair끼리 서로 만나면, 3. DNA ligase가 두 strand를 결합시켜 하나의 recombinant DNA를 만든다. 4. recombinant DNA는 bacteria cell에서 그 clone들을 복제하게 된다. 2 3

Restriction Enzyme 숙주조절제한 (Host-controlled restriction ) 현상 발견 1960년대 어떤 균주의 박테리가 박테리오파아지 감염에 면역성을 보이는 현상을 발견한 것이 제한효소 발견의 시초

Restriction Enzyme restriction enzyme의 종류 sticky end Blunt end Restriction enzymes(restriction endonuclease)는 DNA 내 특정 염기서열을 인식하고 절단하여 double-stranded cut을 만든다. restriction enzyme의 종류 Type I enzyme ; 3개의 subunit으로 이루어져 있으며 target site를 인지한 후 target에서 조금 떨어진 부분의 non-specific site에서 restriction을 유도. ATP가 필요하다. Type II enzyme ; target site를 인지하면 그 site 내부를 자르게 된다. 대부분 palindromic sequence를 인식. sticky end 또는 blunt end를 유도. ATP는 필요없다. Type III enzyme; 2개의 subunit으로 이루어져 있으며, target site를 인지한 후 recognition site로부터 24~26bp downstream에 떨어져 있는 site를 자른다. sticky end Blunt end

insert vector p53

Plasmid DNA 3 2 1 Replication origin 자가복제(self-replication) 가능 2) Antibiotics resistance gene 3) Multiple cloning site(MCS) 4) DNA sequencing(T7, SP6)

Plasmid DNA Replication origin 세포 내에서 자가복제(self-replication) 가능 박테리아 세포 내에는 박테리아가 고유하게 가지고 있는 chromosomal DNA가 한 세포당 하나밖에 있는데 vector는 한 세포 내에서도 스스로 복제하여 수많은 copy가 존재할 수 있다. 2) Antibiotics resistance gene Vector에 존재하는 항생제 내성 유전자를 이용하면 DNA가 세포 내로 주입되었는지 아닌지를 판별할 수 있다. Gene cloning에서는 내가 원하는 유전자가 세포 속으로 들어갔는지가 중요하기 때문에 이런 기능은 필수적이라고 할 수 있다. 이렇게 해서 세포 속으로 DNA가 들어간 세포만을 선별하는 것을 selection이라고 한다. 3) Multiple cloning site(MCS) vector는 일정부위에 제한효소 절단부위가 밀집된 부분이 있어서 cloning에 용이 때로는 이 부분을 이용하여 자신이 원하는 construct를 자유자재로 만들 수도 있다. 따라서 Multiple cloning site가 없는 vector는 이용 가치가 거의 없다. 4) Vector 부위를 이용한 DNA sequencing (T7, SP6), 단백질 발현 가능 Vector에 존재하는 염기서열을 이용한 DNA sequencing을 하기도 편하고, vector에 달린 여러 부분을 이용하여 단백질 발현을 할 수도 있다.

Vector DNA pcDNA3-HA-p53 pcDNA3-FLAG Vector Tagging Gene Flag epitope Hind III KOZAK Flag epitope AAG CTT GCC GCC ACC ATG GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG AGC EcoR I EcoR V Not I Xho I GCG GGC GAA TTC TGC AGA TAT CCA TCA CAC TGG CGG CCG CTC GAG Xba I Apa I CAT GCA TCT AGA GGG CCC TAT TCT ATA pcDNA3-HA-p53 Vector Tagging Gene pcDNA3-FLAG HA : influenza hemagglutinin epitope (YPYDVPDYA) FLAG a small but highly immunogenic peptide (DYKDDDDK)

Insert DNA : p53 p53 http://restrictionmapper.org/ 그전에 EcoR1 / p53/Xho1으로 cloning 되어있던 DNA 를 EcoR1 / Xho1으로 잘라낸다 p53 1 atggaggagc cgcagtcaga tcctagcgtc gagccccctc tgagtcagga aacattttca 61 gacctatgga aactacttcc tgaaaacaac gttctgtccc ccttgccgtc ccaagcaatg 121 gatgatttga tgctgtcccc ggacgatatt gaacaatggt tcactgaaga cccaggtcca 181 gatgaagctc ccagaatgcc agaggctgct ccccccgtgg cccctgcacc agcagctcct 241 acaccggcgg cccctgcacc agccccctcc tggcccctgt catcttctgt cccttcccag 301 aaaacctacc agggcagcta cggtttccgt ctgggcttct tgcattctgg gacagccaag 361 tctgtgactt gcacgtactc ccctgccctc aacaagatgt tttgccaact ggccaagacc 421 tgccctgtgc agctgtgggt tgattccaca cccccgcccg gcacccgcgt ccgcgccatg 481 gccatctaca agcagtcaca gcacatgacg gaggttgtga ggcgctgccc ccaccatgag 541 cgctgctcag atagcgatgg tctggcccct cctcagcatc ttatccgagt ggaaggaaat 601 ttgcgtgtgg agtatttgga tgacagaaac acttttcgac atagtgtggt ggtgccctat 661 gagccgcctg aggttggctc tgactgtacc accatccact acaactacat gtgtaacagt 721 tcctgcatgg gcggcatgaa ccggaggccc atcctcacca tcatcacact ggaagactcc 781 agtggtaatc tactgggacg gaacagcttt gaggtgcgtg tttgtgcctg tcctgggaga 841 gaccggcgca cagaggaaga gaatctccgc aagaaagggg agcctcacca cgagctgccc 901 ccagggagca ctaagcgagc actgcccaac aacaccagct cctctcccca gccaaagaag 961 aaaccactgg atggagaata tttcaccctt cagatccgtg ggcgtgagcg cttcgagatg 1021 ttccgagagc tgaatgaggc cttggaactc aaggatgccc aggctgggaa ggagccaggg 1081 gggagcaggg ctcactccag ccacctgaag tccaaaaagg gtcagtctac ctcccgccat 1141 aaaaaactca tgttcaagac agaagggcct gactcagact ga p53 http://restrictionmapper.org/

Ligation p53 EcoR1 Xho1 EcoR1 Xho1 EcoR1/Xho1 EcoR1/Xho1 HA FLAG FLAG

Procedure 1. plasmid digestion 1. plasmid digestion (with restriction enzymes) pcDNA3-HA-p53 pcDNA3-FLAG Insert MIXTURE insert DNA (1ug/ul) ‘O’ 10X buffer EcoR I (10 U/µl) Xho I (10 U/µl) dH2O 10 ul 5 µl 1 µl 33 µl 50 µl Vector MIXTURE vector DNA (1ug/ul) ‘O’ 10X buffer EcoR I (10U/µl) Xho I (10U/µl) dH2O 5 ul 5 µl 1 µl 38 µl 50 µl  37℃, 2 hrs Total Total * 1Unit : 1 µg의 DNA를 1시간 동안 100 % 절단할 수 있는 제한효소할성단위 참조 Enzyme은 상업적으로 구입하여 사용하는데 Fermentas 회사의 restriction Enzyme을 사용하고 ‘O’ 10X buffer를 사용한다. (다음슬라이드참조)

2. 1 Agarose gel Electrophoresis DNA electrophoresis : DNA fragment를 크기 별로 분류하기 위한 실험방법 DNA molecule은 gel상에서 –  +로 이동하며 그 이동 속도가 DNA 길이와 응축 정도에 영향을 받는 특징을 이용. Seperation이 끝나면 DNA fragment들은 DNA에 결합하는 fluorescent dye인 Ethidium bromide를 이용해 관찰 가능. Fragment들의 길이는 일반적으로 “nucleotides”, “base pairs”, or “kb”로 표기 fragment size는 이미 알고있는 길이의 DNA ladder를 이용해 비교, 판단한다.

Gel electrophoresis sorts DNA molecules by size 2. 1 Agarose gel Electrophoresis Gel electrophoresis sorts DNA molecules by size + – Power source Gel Mixture of DNA molecules of different sizes Longer molecules Shorter Completed gel After digestion by restriction enzymes The fragments are run through a gel – + Longer fragments Shorter x w y z 1 2 Circular forms of DNA migrate in agarose distinctly differently from linear DNAs of the same mass. Typically, uncut plasmids will appear to migrate more rapidly than the same plasmid when linearized. Additionally, most preparations of uncut plasmid contain at least two topologically-different forms of DNA, corresponding to supercoiled forms and nicked circles. The image to the right shows an ethidium-stained gel with uncut plasmid in the left lane and the same plasmid linearized at a single site in the right lane.

plasmid digestion result 2. 1 Agarose gel Electrophoresis plasmid digestion result pcDNA-HA (5.4kb) (kb) pcDNA-HA-p53 8.4 5.4 4.1 2.7 p53 (1182bp) EcoR1/Xho1 1444 (bp) 926 754 1% Agarose gel

2.2 DNA elution from agarose gel electrophoresis한 gel에서 원하는 부분의 DNA band를 얻는 방법. EtBr로 염색한 DNA를 UV상에서 보고 자르는 작업이므로 빠른 시간 내에 해야 UV로 인한 DNA damage 를 최소화할 수 있다. 주의: UV light, EtBr DNA elution Methods DEAE-Cellulose membrane 이용 agarose gel 안의 DNA를 membrane에 붙게 한 후 elution electroelution dialysis bag 에 gel을 넣어 electrophoresis한 뒤 Agarose로부터 빠져나온 DNA 농축 Gene Clean Kit 이용 DNA와 결합하는 glassmilk (silica matrix)를 이용하여 DNA를 신속하게 분리

Protocol of DNA purification Digested Vector 1. Add 100 µl of membrane binding buffer to Enzyme mixture and Mix well by pipetting Binding of DNA SV mini column을 collection tube에 insertion한다. DNA+bfr mixture를 column으로 옮겨준다. 1 min, RT(Room temperature),, incubation 13,000rpm, 1min → Flowthrough 제거하고 column은 다시 제자리 Washing 700 µl of membrane Washing buffer → 13,000rpm, 1min → Flowthrough 제거 500 µl of membrane Washing buffer → 13,000rpm, 1min → Flowthrough 제거 Column only → 13,000rpm, 1min Elution Column을 new 1.5ml tube로 옮기고 50 µl of Nuclase free water RT, 1min incubation → 13,000rpm, 1min

Protocol of DNA elution from agarose gel Gel slice (DNA 함유하고있는 gel) 1. Agarose에서 원하는 밴드를 잘라 1.5 ml tube에 넣는다. Add 100 µl of membrane binding buffer per 100mg of gel slice (우리의 gel 의 무게는 300-400 mg 가량 되므로 400 ul의 buffer를 넣는다) 3. Vortex & Incubate at 50-65 ℃ (gel이 완벽히 녹을때까지) Binding of DNA SV mini column을 collection tube에 insertion한다. Dissolved gel mixture를 column으로 옮겨준다. 1 min, RT, incubation 13,000rpm, 1min → Flowthrough 제거하고 column은 다시 제자리 Washing 700 µl of membrane Washing buffer → 13,000rpm, 1min → Flowthrough 제거 500 µl of membrane Washing buffer → 13,000rpm, 1min → Flowthrough 제거 Column only → 13,000rpm, 1min Elution Column을 new 1.5ml tube로 옮기고 50 µl of Nuclase free water RT, 1min incubation → 13,000rpm, 1min

3. Ligation 두 DNA strand의 sticky end에 hydrogen bond (A-T and G-C pairing)가 형성되면 LIGASE가 energy source를 이용하여 phosphodiester bond를 연결시켜서 DNA를 결합시킨다.

3. Ligation Procedure ligation MIXTURE Vector DNA 100ng insert DNA 66ng 10X ligase buffer T4 ligase 3U dH2O .. µl 2 µl 0.5 µl 20 µl * cut pcDNA3-FLAG * cut p53  36 ℃, 1 h~ Total * Ligation ratio : 다음슬라이드참조 300mM Tris-HCl (pH 7.8 at 25°C) 100mM MgCl2 100mM DTT 10mM ATP T4 ligase 의 정보 http://kr.promega.com/~/media/Files/Resources/Protocols/Product%20Information%20Sheets/G/T4%20DNA%20Ligase%20Blue%20White%20Cloning%20Qualified%20Protocol.pdf

: = : = 1 : 3 3. Ligation Ligation ratio 1 : 3 5,400 bp 1,182 bp Vector size Insert size 1 : 3 Vector (ng) Insert (ng) : = 5,400 bp 1,182 bp 1 : 3 100 (ng) Insert (ng) : = p53

이해경 : leehaekyung2@gmail.com (S402호) 결과 Report 및 Quiz 공지 제출기한 : 추석연휴 후 9월 23일 월요일 오후 2시까지 !!!!!! 제출장소 : S402호 앞 바구니 (암발생 및 세포노화연구실) (늦게 제출 시 감점) 1. 반드시 손글씨로 작성합니다. 2. 인터넷 등 각종 자료를 그대로 인용하는 경우는 감점합니다. 3. 자료 인용 시 반드시 Reference를 씁니다 4. 반/ 조/ 학번/ 이름을 반드시 기재합니다 5. 미제출시 0점 처리합니다. 6. 제목/목적/원리/실험내용/결과,분석/고찰,문제풀이/참고문헌 7. cloning의 각 단계별로 그 목적, 원리, 내용, 결과를 반드시 적을 것 8. 실험결과는 사진을 첨부하거나 기록하고 반드시 결과에 대해 고찰합니다 9. 기타 수업 및 레포트 관련 문의는 이해경 : leehaekyung2@gmail.com (S402호) 1. 결과 Report 작성포인트

2. Quiz 1. Recombinant DNA의 정의와 Gene클로닝의 목적을 설명하시오. 2. 본 수업에서 실험한 p53의 subcloning의 개략적인 step에 대해 쓰시오. (vector 준비과정, insert 준비과정, 이름모두 기입 할 것) 3. Restriction Enzyme을 종류를 간단히 설명하고 특히 Type II Enzyme의 3가지 유형의 예를들고 아래와 같이 cleavage 되는 부분을 표시하시오. ex) 4. DNA 전기영동을 할 때 TAE buffer나 TBE buffer를 사용하는데 각 버퍼의 조성을 조사하고 그 각각의 성분은 어떠한 역할을 하는지 알아보세요. 5. DNA를 Agarose gel로 전기영동하면 supercoiled DNA 와 Enzyme digested DNA의 band 는 각각 어떻게 보이겠는가? 그 이유에 대해 그림과 함께 설명하시오. 6. Isoschizomer와 compatible end는 무엇이며 차이점을 설명하시오. 어떤 DNA 염기서열 내에 restriction enzyme site가 있는지 검색하는 일은 중요하다. p53유전자 CDS 내부에 존재하는 restriction enzyme site를 검색해보시오. (restriction enzyme site 검색 프로그램으로 검색하고 프린트할 것) 11번슬라이드 Ligation을 할때 한 종류의 restriction enzyme을 사용할 경우 vector DNA가 self-ligation 될 수 있는데 이러한 현상을 방지하는 실험방법을 알아보시오. (힌트 Phosphatase)