제3장 발효와 대사 3-1. 기본 대사과정 3-2. 2차대사산물의 생합성과정과 제어 3-3. 대사제어 및 발효의 전환

대사(metabolism) - 미생물이 물질을 체내에 흡수하여 분해하거나 생체구성성분으로 재합성하는 작용 : 이화작용(분해하는 작용) ↔ 동화작용 (체성분을 구성하는 작용) - 1차대사 + 2차대사  1차대사 : 기본대사 (생명체의 유지/증식), 에너지획득대사, : 해당과정, TCA, 전자전달계, 기타 부대사과정… : 생체고분자 합성에 필요한 소재를 공급하기 위한 대사 예, 유기산, 아미노산, 비타민, 알코올, 용매, 지방, 지방산, 핵산 등  2차대사 : 합성반응, 생체의 생명유지 외에 중요한 역할 예, alkaloid, terpenoid, phenol류, 항생물질, 색소 등 : 특정시기, 특정조직에서 생성 - 경제적 유용성, 형질발현의 조절이 가능 : 식물이나 미생물에 국한

3-1. 기본대사과정 3-1-1. 혐기적 대사와 호기적 대사 : ATP 생성 대사계  발효, 호흡, 광합성 (복잡한 과정) 발효(fermentation) - 에너지 생성단계 중 가장 간단함 - 유기물이 분해되고 그 분해산물이 산화환원을 통하여 ATP를 생성 - 유기화합물 자체가 최종 전자수용체 O= +1, H= -0.5 일 경우 C6H12O6  CO2 + C2H5OH + 57 kcal (-0.5x12+1x6) = 2(1x2)+2(-0.5x6+1x1) 0 = 4-4 (산화환원의 balance는 유지) - 전이과정을 통하여 수소원자의 공여와 수용(NAD/NADH 및 NADP/NADPH) - 한정된 범위 내에서 유기화합물만이 발효의 기질로 된다.  탄수화물 – 유기산, 아미노산, purine, pyrimidine, 동식물의 고분자물질 등  기질수준인산화에 의해서 생성 – ATP (혐기적 조건) - 편성혐기성, 통성혐기성(산소존재 호흡으로 전환)

2. 호흡(respiration) - 무기 또는 유기화합물이 전자 공여체(electron donor)  주로 무기화합물이 전자공여체로 되어 전자전달계를 거쳐 ATP를 생성 - 분자상의 산소가 전자수용체 (electron donor)  (호기성 호흡) - 산소 이외에 NO3-, SO42-, CO32- 가 전자수용체  (혐기성 호흡) - 가역적으로 산화/환원되는 전자공여체, 전자 carrier, 전자수용체 화합물  산화환원효소에 촉매, 낮은 곳에서 높은 곳으로 사슬을 형성  전자 carrier 화합물: Flavoprotein, 보효소 Q, 각종 cytochrome 등이 있다. - 혐기성 종속영양미생물의 전자전달계  cytochrome 산화효소의 촉매  산소와 반응  carrier는 환원된 후 재산화  산소는 환원되어 물 (전자전달계의 길이, 전자공여체, 말단의 전자수용체 등이 달라짐

호기성 미생물 - 산화적 인산화의 과정  ATP를 생성  진핵생물의 미토콘드리아에서  전자전달계와 산화적 인산화 공역부위 (NADH와 flavin, cytochrome b/c, cytochrome a/O2, - P/O 비  NADH(3), cytochrome b이후 전달되는 숙신산(2)  cytochrome c이후에 전달되는 아스코빈산(1) - 전자전달계에서 방출되는 자유에너지를 고에너지 인산으로 변환하는 기작  화학삼투압 공역설이 가장 유력 - 발효 : 포도당  젖산으로 변환 화학적 변화 C6H12O6  2C3H6O3 + 52 kcal 생화학적 변화 C6H12O6 + 2ATP + 2Pi  2C3H6O3 + 2ATP - 포도당  완전산화 (TCA, 호흡계) 화학적 변화 C6H12O6  6H2O + 6CO2 + 686 kcal 생화학적 변화 C6H12O6 + 6O2 + 38ADP + 38Pi  6H2O +6CO2 + 38ATP

- 호흡과 발효 비교  화학에너지 ; 호흡> 발효 (13배)  ATP 수득량 : 19배 - 불완전 산화 (최종산물이 유기물로 종결하는 과정 순수한 발효과정)  에탄올 – 초산 등  포도당  gluconic acid, itaconic acid 로 산화

3-1-3. 탄수화물의 혐기적 대사  산소를 이용하지 않고 당을 분해하여 화학에너지를 얻는 과정  EMP 경로 3-1-3. 탄수화물의 혐기적 대사 (1) 해당과정  산소를 이용하지 않고 당을 분해하여 화학에너지를 얻는 과정  EMP 경로 ○ 산소가 없을 경우  불완전 산화 - 젖산발효 (pyruvate  lactate dehydrogenase ) glucose + 2Pi + 2ADP  2 lactate + 2ATP + 2H2O ᇫGo’ = -32.4 kcal - 알코올발효 ( acetaldehyde  lactate dehydrogenase ) glucose + 2Pi + 2ADP  2 ethanol + 2CO2 + 2ATP + 2H2O ᇫGo’ = -25.4 kcal ○ 산소가 존재할 경우 - TCA 회로를 통하여 CO2 + H2O 로 완전산화

2) Phosphoketolase - 정상 젖산발효균  단일 젖산 이상 젖산발효균  젖산 이외에 초산이나 에탄올을 함께 생산  transaldorase, transketolase, Aldorase 가 없음 - 이상 젖산발효균 glucose  lactate + ethanol +CO2 + 2ATP - 젖산균  cytochrome 계 호흡효소, TCA 회로가 없음  호기적 또는 혐기적 어느 조건에서도  1 mols 포도당  2 mole ATP 생성 3) 각종 혐기적 발효 - 알코올발효, 젖산발효, Butanol-acetone 발효, 낙산발효, Propionic acid 발효 등 - 포도당  EMP경로, HMP경로, ED경로를 거쳐 pyruvate 생산

4) Malo-lactic 발효 - 사과산이 젖산균에 의해 젖산으로 분해되는 과정 (포도주 생산과정에서 발생)  산의 감소를 가져와 순하고 부드러운 포도주를 생산 - NAD 의존성 malic enzyme  Pyruvate  Lactic acid Leuconostoc mesenteroides  효소 없이 L-malate  L-Lactate로 전환

3-1-4. 탄수화물의 호기적 대사 (1) TCA cycle - 1937년 Kreps  동물조직에서 발견 3-1-4. 탄수화물의 호기적 대사 (1) TCA cycle - 1937년 Kreps  동물조직에서 발견 - Tricarboxylic acid(TCA)회로 또는 구연산회로 - 포도당은 호기적 조건(호흡)에서 이산화탄소와 물로 완전히 산화  생화학적 변화 : C6H12O6 + 6O2 + 38ADP + 38Pi → 6H2O +6CO2 + 38ATP - TCA회로의 주요 기능     1) 생체에너지 생성 (ATP)    2) 환원력 생성 (NADH+H+, FADH2)     3) 생합성에 필요한 탄소골격을 제공  생합성에 필요한 전구물질을 제공         a.  3-phosphoglycerate: serine, cysteine, glycine                                                                  b.  pyruvate: alanine, valine, leucine          c.  α-ketoglutarate: gulutamate, glutamine, proline, arginine          d.  oxaloacetate: asparate, asparagine, methionine, threonine, lysine, isoleuicine

2. Glyoxylate 회로 - glyoxylate와 acetyl COA 가 축합하여 C4 화합물을 축합 1) isocitrate = glyoxylate+ succinate 로 분해 2) glyoxylate와 acetyl CoA 가 축합 - TCA의 정상적인 작동을 가능 - “ 회로의 측로도” 가능 : acetyl CoA 두 분자가 5개의 효소에 의해 1분자의 malate를 생성

3. 6탄당 인산화 (hexose monophosphate; HMP) 경로 - 호기적 분해에 의한 당분해경로  제2 대사경로로 해당경로와 구분 1) 중간대사산물이 5탄당 (5탄당 인산화회로; pentose monophosphate pathway)    2) 생합성에 필요한 환원력 생성 (NADH+ H+)    3) 아미노산 합성에 필요한 전구체 (erythrose-4-P): tryptopan, tyrosine, phenyalanine    4) 핵산 생합성의 전구물질 생합성 (ribose-5-P)    5) 광합성에 필요한 전구물질 생합성 (ribulose-5-P) 6) EMP: HMP 의 비율  대장균 = 72 : 28  S. cerevisiae = 88 : 12  Peni. chrysogenum = 56~70 : 30~44  Rhizopus oryzae = 100% EMP  Acetomonas oxydans = 100% HMP

해당과정

4. Entner-Doudoroff (ED) 경로 1) phosphofractokinase가 결여  Zymomonas, Azotobacter, Streptomyces, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhizobium등 2) G-6-P  Pyruvate와 glyceraldehyde-3-P 포도당 1분자- 1분자 ATP 3) 균주 p 70

2차 대사산물의 생합성과 제어 3-2-1. 1차 대사와 2차 대사 1차대사: 생명유지에 필요한 대사(본류) 2차대사: 1차 대사에서 분지되어 특정조건에서만 진행(지류) - 구분이 명확하지는 않다. 2차대사의 특징 - 다종 다양 (분지된 다양한 대사계에서 생산) - 화학구조가 유사한 물질이 하나의 배양계에서 생산될 가능성이 많다 (1차에서 유도된 2차대사 산물) - 특이 생산기 (idiophase)에서 생산되어  특이 대사산물이라 함 - 계대배양 또는 변이 처리시 쉽게 소실

3-2-2. 2차 대사산물의 합성경로 2차대사  출발물질(1차대사산물)  변환, 중합, 축합에 의해 다양한 구조 3-2-2. 2차 대사산물의 합성경로 2차대사  출발물질(1차대사산물)  변환, 중합, 축합에 의해 다양한 구조 생화학적 반응  산화환원, 메틸화, 할로겐화 등

초산이 관여하지 않는 경로 - 해당과정, 5탄당 인산경로 등  pyruvate 가 되기전 과정에서 유래하는 경로 1) 포도당에서 직접 유래하는 경우 : kolic acid (Aspergillus), muscarine (Amanita muscarina) 2) Sikimic acid 에서 유래하는 경우 : 균류  caffeic acid, p-hydroxybenzoic acid, pyrogallol, anisaldehyde 등 : 방선균  chloramphenicol, novobinocin 등 3) 5탄당 경로를 거쳐 nucleoside 가 되는 과정에서 관련된 경로 : 방선균  puomycin, blastocidin S, polyoxin emd : 균류  cordycepin (2) 지방산대사와 관련된 경로 1) 지방산을 출발물질로 하는 경우 : 고등식물  polyacetylene : 균류  cyclopentane 유도체 (prostaglandin, brefeldin A) 2) 지방산합성 경로에서 파생된 경로 : 다수의 polyketide 유래 2차 대사산물

(3) Terpen, steroid 대사에 관련된 경로 Acetyl CoA를 기점 Terpen, steroid의 합성경로에서 중간체(mevalonic acid)  carboxyl기(탈탄산)  isoprene 골격(축합)  Terpen, steroid : fumagillin, geosmin, gibberelin, helvolic acid 등 (4) TCA 회로와 관련된 경로 1) 중간물인 유기산 유래 : a-ketoglutaric acid  환원된 glutaconic acid, aconitic acid의 탈탄산  itaconic acid 2) 초산에서 유래된 지방산과 TCA 회로 중간체와의 축합산물 : erythroskyrin (penicillium islandicum) : agariric acid, rubratoxin (5) 아미노산 대사에 관련된 경로 1) 단일아미노산 유래 : 방선균 cycloserine, azaserine, b-nitropropionic acid 등 : 항생물질(duazomycine), 살충성분(tricholomin, ibotenic acid 등) : tryptophan 유래물질(psilocybin, indigo) 2) 2개의 아미노산이 diketopiperazine 환을 형성한 것

2) 2개의 아미노산이 diketopiperazine 환을 형성한 것 : Aspergillic acid, gliotoxin ; penicillin, cephalosporin(cystein, valine의 축합체) 3) 2개 이상의 아미노산이 축합된 것 : 2개이상의 아미노산이 직선상으로 peptide 결합 (gramicidin A; enniatin) : 환상으로 진열된 항생물질(actinomycin, polymyxin, bacitracin, viomycin, tyrocidine) 3.2.3 2차 대사산물의 생합성 및 생산제어 : 1차 산물의 제어보다 어렵다

1차 대사제어에 의한 2차 대사제어 - tryptophan 첨가  pyrolnitrin 이나 chloramphenicol 의 생합성이 증대 - valine 첨가  penicillin 합성이 증대 (2) 생합성과정 중의 물질에 의한 제어 - p-aminophenylalanine 첨가  allylamine 합성효소 제어  chloramphenicol 생산억제 (3) Catabolite 제어 - 포도당을 첨가 (이성화 효소의 생성이 억제)  penicillin, bacitracin, patulin, 맥각 alkaloid의 생산 억제 - 제어회피전략  탄소원의 공급방법개량, 균주의 유전적 조작 등 검토 (4) 무기인산에 의한 제어 - 무기인산 (10g/L) 첨가  claviceps 의 생육 증가  alkaloid 생산은 저해 (트립토판첨가시 저해가 억제)  amphotericin B(polymacrolide 계) 등 저해 - 인산염이 세포내 ATP 수준을 조절  에너지전하가 항생물질의 생합성개시의 effector로 작용

(5) 질소 catabolite 제어 - 질소원의 과량첨가로 2차대사산물의 생합성이 억제 - 암모니아의 첨가  oleandomycin, novobiocin, candihexin 등의 생산억제 (6) 금속이온에 의한 제어 - 금속이온의 첨가  2차대사산물의 생합성에 영향을 미침 - Mg2+, Ca2+, Zn2+, Co2+ 등의 금속이온  적당량 첨가시  활성 촉진 예) Mg에 의한 생산 촉진 St. kanamyceticus 의 kanamycin 생산 St. fradiae 의 neomycin  효소작용의 촉진, 세포벽에 흡착된 항생물질의 유리를 촉진 (7) 미량제어 인자 A-factor  St. gricerus의 streptomycin 생성을 촉진 R-factor  Nocardia mediterranea의 rifamycin 생성을 촉진 Sclerin  Sclerotinia libertiana kanamycin 생성을 촉진

(8) 공통 전구체에 의한 제어 - pencillin  streptonycin 생산을 증대(세포벽합성 저해) - bacitrain  neomycin or kanamycin 생산을 촉진 - glucosamin  streptomycin의 합성/세포벽합성의 공통전구체 (9) 막투과성의 제어 - Palmitic acid, oleic acid 등의 지방산 첨가  세포벽중의 지방산조성의 변화  막투과성의 변화 aminoglycoside 계 항생물질(neomycin, istamycin)의 생산이 증대 (10) 최종산물의 축척이나 첨가에 의한 생산조절 - Erythromycin 의 첨가  Erythromycin의 생성을 촉진 - 일반적으로 feedback에 의한 저해가 나타남  개량을 통하여 생산을 촉진하도록 노력  St. noursei  fungicidin 과 cycloheximide 를 생산  전자를 가  후자의 생산이 촉진  후자를 가  전자의 생산이 촉진

3.3 대사제어 및 발효의 전환 - 효소합성조절  coarse control - 효소활성조절  fine control 3.3.1 효소합성조절 (1) 효소의 유도 - 유도효소 : 효소의 기질이나 analogue 가 존재 시 생성  효소합성을 유도하는 기질 – 유도물질(inducer)  analogue(효소유도에 의해 대사되지 않는 물질) – gratuitous inducer - 구성효소 : 조성에 관계없이 항상 합성 - 효소합성의 유전적 조절기작  Operon 가설 (Jacob & Monod)  Lactose operon

조절인자 : cAMP, cAMP recepter protein

 합성이 억제 (억제효소, repressible enzyme) - 특이적 저분자 물질이 다량존재  합성이 억제 (억제효소, repressible enzyme)

(2) 효소억제 1) 최종산물억제 - 최종산물에 의해 효소합성이 억제 예) Aspartic acid 계열 생합성경로에서 최종산물(lysine, methionine, isoleucine 등)  key enzyme 인 aspartokinase를 억제 - 생산물이 증가  억제 - 산물의 농도가 감소  억제해제(derepression)  효소의 양/산물의 생산을 증가 2) 이화대사 산물억제 - 용이하게 대사되는 기질이나 그 대사산물이 존재  제2의 기질용액에 필요한 효소합성 억제  cAMP 첨가  억제해제 (cAMP  cAMP receptor protein과 결합  mRNA 촉진)  포도당 등 존재  세포내 cAMP의 농도가 감소  효소합성을 억제)

3.3.2 효소활성제어 (1) 최종산물제어 - 생산물이 과량 생산되었을 때 최초의 반응을 촉매하는 효소의 활성을 저해하는 현상 - feedback 저해를 받는 효소  allosteric enzyme 라 한다. - Allosteric enzyme  활성부위와 allosteric effecter와 결합하는 allosteric 부위  저해제가 결합  구조적인 변화  활성을 상실 - 생산물저해의 종류 1) 협주적 생산물저해 2) 협동적 생산물저해 3) 누적적 생산물저해 4) 연쇄형 생산물저해 활성부위 Allosteric 부위

1) 협주적 생산물저해(concentrated end product inhibition) : Corynebacterium glutamicum의 homoderine 요구 균주를 이용한 lysine 발효 : Aspartokinase  lysine과 threonine 이 존재 시 억제 H. 양을 제한하여 Threonine의 합성을 억제  Lysine이 다량 축척

2) 협동적 생산물제어(cooperative end product inhibition) : 복수의 종말대사산물이 각각 단독으로 저해하지만 두 개의 대사산물의 양이 동시에 과잉으로 되면 단독저해보다 강한 저해를 나타냄 3) 누적적 생산물 저해 (cumulative end product inhibition) : 최종산물이 모두 과잉량으로 공존할 때 그 작용이 누적되어 강력한 조절작용을 나타냄 : glutamate synthase 에 대한 8종의 최종산물이 누적적 저해

4) 연쇄형 저해 (Sequential inhibition) - B. subtilis 의 방향족 아미노산 생합성계 제어  종말대사산물에 의한 제해가 이닌  분기점의 대사중간체에 의한 저해

(2) 효소의 화학적 변형에 의한 제어 - 특정 물질이 효소단백질의 구조를 변화  공유결합에 의한 화학적 변형  활성제어 - 화학적 변형  인산기, adenyl 기 (AMP기), methyl 기, acetyl 기 등이 부착, 이탈  활성에 변동

(3) 전구체 효소 및 잠재효소 - Protease 등  효소활성을 가지지 않는 전구단백질로 합성  세포에 의해 적당한 시기에 활성화  본래 기능  전구체 단백질 (전구체 효소, zymogen) - nuclease  세포 내에서 천연의 저해제에 의한 불활성화 상태로 존재  적당한 시기에 활성화  불활성화 효소 – 잠재효소(latent enzyme)

3.3.3 대사제어발효 : 미생물의 대사를 임의적으로 개변/제어  발효생산물을 대량생성/축척 시키는 발효  대사제어 발효 : 아미노산 발효와 핵산발효 (1) 환경조건에 의한 발효의 전환 제어 : 환경조건에 의해 발효를 전환/제어하는 방법 (산소)  알콜발효 : 혐기적발효  빵 효모나 미생물단백질 : 호기적 발효 : 글루탐산 발효  생성물의 변환  산소공급 불충분 : 젖산이나 호박산  암모니아 과잉 : 글루타민산 부족 : a-ketoglutaric acid Alcoholic Fermentation

(2) 세포막 투과성에 의한 조절 - 글루타민산 발효  바이오틴 과잉 ; 세포막이 단단  세포 내 산의 함량 증가  합성억제  oleic acid로 대체/Penicillin 첨가: 세포막의 합성을 저해  세포 외로 유리/합성증가 - 핵산발효  Mn 과잉 : 균체증식 촉진/nucleotide 생산량 저하 : 막투과성과 관련 : 항생물질/계면활성제 첨가  효과적임 (3) 변이에 의한 대사조절 1) 영양요구변이주의 이용 - 중간 대사물을 축적시키는 방법 - 중간 대사물 C를 생산  효소c가 결여된 변이주 생산  E를 생산할 수 없어 생육이 불가능 : 영양요구 변이주  feedback 저해를 받지 않을 정도로 E를 첨가  C가 왕성하게 합성  축적 - 영양요구주를 이용  Feedback 저해나 억제를 해제하고 대사 balance 를 붕괴시켜  목적물질을 대량생산 예) lysine, threonine, ornithine

예 2) 핵산발효 - 이노신산(5’IMP) 생산균주 (Brevibacterium ammoniagenes) - SAMP(adenylsuccinate) 합성효소가 결여된 adenine 요구 변이주 2) 아나로그 내성변이주의 이용 - 아나로그란 최종화합물과 화학구조가 유사한 물질(대부분 비천연물) - 강력한 저해나 억제작용, 생체구성성분의 생합성에는 최종산물처럼 이용할 수 없다 : metabolite analog 또는 antimetabolite라 함 - Analog 내성 변이주 : 아나로그 존재 시 정상적인 세포는 대사과정이 진행되지 않아 생육 X  그러나 이러한 조건에서 생육하는 균주를 일컬음  아나로그가 다량 존재시 최종산물이 생산 세포구성성분이 합성 생육  feedback 억제를 받지 않음  제어를 받는 효소가 feedback 제어 불감수성의 탈감작상태로 되어 represser가 정상적인 제어기능을 상실 대사제어 붕괴  특정의 대사산물을 대량생산

2) 아나로그 내성변이주의 이용 예) 아미노산, nucleotide, 비타민 등의 생산에 널리 이용 대표적인 analog의 예– 표