유전공학 10장. 특정유전자의 cloning

Gene cloning의 목적 및 성패 1. Gene cloning 의 목적. 1) 분자생물학의 기초자료를 제공. 유전자의 구조, 기능을 밝히기 위함. 2) 유용단백질을 짧은 시간에 다량 획득. 의약품, 효소생산 : 단가낮춤. 2. Gene cloning의 성패. 1) 유용유전자를 갖고 있는 Clone을 직접 선택할 수 있는지? 2) 다른 재조합체 들과 구별할 수 있는 방법이 고안되어 있는가? *** Gene cloning의 역할과 이용성 및 단일 특정 유전자의 클론을 얻기 위해 이용되는 방법 언급.

Clone 선발의 문제 약 50 Kb의 DNA를 Eco R1으로 처리시, 이론적으로 50,000/46 = 12.2(13개의 절편). 많은 단편이 생성된다. 13종류의 재조합 DNA가 생성된다. 형질전환 시켰을 때 13종류의 형질전환 체 형성. 원하는 특정(목적)의 유전자가 Cloning 된 재조합 DNA를 갖고 있는 형질전환 체를 선발해야 함.

형질전환 체 선발의 문제 수 천 개의 재조합체로부터 필요로 하는 재조합체 분리 형질전환 체 선발의 문제 수 천 개의 재조합체로부터 필요로 하는 재조합체 분리

유용유전자 직접 선발

항생제 저항성 유전자의 직접 선발 R6.5: Kanamycin, Streptomycin, Chloramphenicol, Sulphonamide

trp A gene의 cloning Total DNA와 vector DNA : 제한효소 처리. 절단된 두 종류의 DNA를 혼합하여 연결효소(ligase)를 처리한 후, 두 DNA를 연결시킨다(ligation). Ligation mixture를 Competent cell(trp- cell)에 형질전환 시킨 후, LB 배지에서 1~2시간 배양. LB 배지에서 배양된 세포를 최소배지에 smear(도말). 37℃에서 16~18 시간 배양. 형질전환 체(Transforment) 분리.

표지형질 회복에 의한 직접 선발

표지형질 회복의 사용범위 및 제한 알고자 하는 유전자에 대한 돌연변이체 숙주세포가 있어야 함. 영양 요구성 돌연변이체(Auxotroph mutant). 야생 주만이 자랄 수 있는 배지인 최소배지가 있어야 함(Minimal medium). ※ 효모나 사상균도 영양 요구 성 돌연변이체를 만들어 이들 미생물의 cloned gene 선발에 이용할 수 있음.

Clone 확인 방법(Hybridization) 상보적인 핵산 가닥은 서로 혼성화 된다.

혼성화(Hybridization) 탐 침 법 활용 탐 침 자(Probe)로 사용할 수 있는DNA 분자. 필요로 하는 유전자가 세포 내에서 고도로 발현되고, 그 세포로부터 cDNA 클론 도서관을 만들었을 때. 한 유전자에 의해 암호 된 단백질의 아미노산 서열이 완전히 또는 부분적으로 알려진 경우. 유전자가 동일한 집단 또는 관련이 있는 유전자 중의 한 유전자 일 때.

유전자 도서관(Genomic library)에서 단일 클론의 확인 Cosmid vector DNA 이용.

특정 세포에서의 유전자 발현 이용 밀(Gliadin gene), 이자(Insulin gene).

cDNA cloning의 모식도

역 전사 효소를 이용한 cDNA

Colony hybridization (in situ probing method)

Colony hybridization (in situ probing method)

방사선 동위원소 부착 법

Autoradiography

cDNA 도서관을 분석하기 위한 풍부한 탐 침 법 A, B colony로부터 probe제조. Colony hybridization.

Cytochrome C 유전자에 대한 Oligonucleotide 탐 침 자 이용

해독산물이 확인된 유전자에 대한 Oligonucleotide 탐 침 자 이용 Cytochrom c 59번에서 64번 아미노산 서열. 16개의 가능한 염기서열. TGG - GATc – GAAc – AATc – ATG. Trp – Asp – Glu – Asn – Met.

Oligonucleotide 합성 모식도

Oligonucleotide를 이용한 cytochrome c 유전자의 clone확인

이종 검색 법을 이용한 유전자 확인 효모와 Neurospora의 Cytochrome gene(상동 성)

Cloned gene 해독산물 탐 지 법. 혼성화 탐 침 법(Hybridization probing). 1회의 실험으로 10.000개의 재조합체를 선별할 수 있음. Immunological screening(면역학적 검색 법) 혼성화 방법을 이용할 수 없을 때 사용 방법. 클론 된 유전자에 의해 생성된 단백질로부터 항체를 만들어 항원-항체 반응을 통하여 재조합체를 선별할 수 있음.

항체 제조

항체를 이용한 재조합체 선발

유전자 발현의 문제점 식물과 동물 유전자를 대장균 vector에 결합시켜 제조한 재조합 DNA. 세균 세포 내에서(E. coli) 발현 안 됨. 원 핵 유전자는 진 핵 세포 내에서 발현 안 됨. 발현 vector(Expression vector) 필요함. ※ 혼성화 탐 침 법이 면역학적 검 침 법보다 빠르고 효과적임. 명확하고 모호하지 않은 결과를 가져옴.

유전자 발현에 미치는DNA 염기 서열