임목생물공학 및 실험 기내 미세환경 조절.

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1 임목생물공학 및 실험 기내 미세환경 조절

2 식물생명공학이란 ? 식물체 또는 식물유래 물질을 활용하여 산업적으로 유용한 제품 또는 공정을 제조하거나 개선하기 위한 기술
1세대 생명공학 : 최종생산물의 특성을 유지하면서 생산력을 증가 제초제 내성 등,영농 특성을 개선 2세대 생명공학 : 최종생산물의 특성을 변형시키는 것 백신, 항암 성분 등의 특성을 개선 식물생명공학분야 1) 재조합 DNA 기술을 이용한 형질전환 식물체 개발 2) 조직배양기술을 이용한 유용 식물체의 생산 3) 세포배양기술을 이용한 유용물질 생산

3 식물조직배양 이란? 무균상태에서 영양배지 위에 식물, 종자, 배, 기관, 식물체의 단편, 조직, 세포 또는 고등식물의 원형질 등을 배양 유전적으로 동일한 개체를 비교적 적은 공간과 장비로 빠른 시일 내에 대량으로 생산이 가능하게 합니다 증식율이 낮은 영양번식식물의 증식과 유전적으로 균일한 개체를 증식하고자 할 때 사용 양란의 경우 생장점 배양을 통해 대량증식이 가능 – 희귀식물의 대중화에 기여 영양번식식물의 무병식물체 생산가능(감자, 딸기, 카네이션등)

4 생물공학의 발달사 캘러스 형성의 발견 : 더하멜(Duhamel)에 의해 발견 ❖ 미분화된 식물세포 “덩어리”를 캘러스.
❖  미분화된 식물세포 “덩어리”를 캘러스.   이렇게 캘루스가 생겨나는 것을 탈분화 캘루스에서 다시 잎이나 뿌리가 생겨나는 것을 재분화 ❖ 이렇게 캘러스가 다시 식물로 발현 될 수 있는 이유 식물세포의 전분화능력 (totipotency) SIMON(1908)이 포플러의 줄기를 배양하여 캘러스·뿌리 및 눈을 얻는데 성공함으로써 세포의 전형성능에 대한 가설은 힘을 얻게 되었다. 전분화능력이란 단 한 개의 살아있는 세포만 있으면 하나의 개체 식물체를 만들수 있다.

5 세포설 된 작은 방 같은 것을 ‘세포(Cell)라 함. ❖ 세포설: 세포는 생물체의 구조적 기능적 기본 단위이다.
❖ 세포의 발견: 1665년 영국의 물리학자 로버트 훅 (R. Hooke)이 코르크를 관찰한 후 관찰 된 작은 방 같은 것을 ‘세포(Cell)라 함. ❖ 세포설: 세포는 생물체의 구조적 기능적 기본 단위이다. 생물은 외형이 어떻든 모두 세포로 이루어져 있고, 세포야말로 생물의 구조와 기능의 궁극단위이며, 생명의 본체라는 학설이다 슈반(T. Schwann) : 1839년 동물 세포설을 찬성, 세포설은 생물전체에 해당 한다고 제창 슐라이덴(M. J. Schleiden) : 1938년 식물 세포설 세포설은 생물현상의 원리에 관한 19세기의 중대 발견의 하나로 다윈의 진화론과 맞 먹 는다고 할 수 있다. 이 설이 확립됨으로써 원생동물의 분류학상의 위치가 결정되고, 정자 나 난자도 세포라는 것이 알려졌다. 원형질이나 원형질 연락의 발견에 의하여 이 설에도 반대자가 생겼다 ex) 드바리는 1859년에 세포가 식물체를 만드는 것이 아니라 식물이 세포를 만든다고 하였다. 즉, 원형질이야말로 생명의 본체이며, 세포는 생물개체를 만들고 있는 원형질이 부분적으로 구조 분화한 결과로 생긴 것이라는 주장으로 이를 원형질설이라고 한다.

6 ❖ 조직 배양에 의한 대량번식은 산업화되어 있는 기술로 지금까지 광범위한 식물의 번식에 적용되어 오고 있음.
❖ 기존의 조직 배양법이 직면하고 있는 가장 큰 문제는 높은 생산비용으로 이는 주로 높은 노임과 대량증식 기간 동안의 생장율의 저조, 발근불량 및 순화과정 동안의 유식물체의 생존률 저하 등에 기인한 것.그러므로 생산비를 절감시키기 위해서는 1) 기내에서 건전묘를 생산하여 포장 활착율을 높 일 것 2) 순화 과정 중 발근과 신초의 생장을 동시에 촉진할 수 있을 것. 3) 배양과정 중 발생할 수 있는 오염에 의한 손실을 줄일 것. 4) 배지의 분주, 접종 등 배양 기술의 자동화를 유도하지 않으면 안됨. ❖ 재래식 조직 배양법은 기내 미세환경에 관해서는 별로 관심을 기울이지 않았으며 배지의 물리적, 화학적 성질을 조작함으로써 증식율을 높이는 데만 관심을 기울여왔다면 ❖ 1990년대 들어서면서 미세 번식의 자동화를 위해서 Bioreactor system이나 자동액체 배지 feeding system 기술이 개발되어 광자가 영양번식을 통한 생산비절감의 가능성도 보고 되었으며 이 번식방법은 1) 환경조절이 용이하고 2) 증식율과 생존율을 높이고 3) 생물학적 오염을 감소시키고 4) 큰 배양용기를 이용할 수 있으며 5) 단순한 수작업과 자동화에 의한 노임절감 및 전반적인 미세번식과정의 단순화 의해 기내 혹은 기외에서 유식물체의 생장을 촉진시킬 수 있게 됨(Kozai1991).

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8 기내배양시 관여되는 환경요인 ❖ 각 환경요인들의 평균수치뿐 아니라 시간과 공간에 따른 변이가 식물체의
생장, 발육 및 형태형성에 영향을 미침. 즉 기내환경의 변이는 배양중인 식물체 나 배지 그리고 배양요기 밖의 환경에 의해서도 영향을 받음. ❖ 배양용기내 미세환경은 온실 및 생장상의 내 외부환경변화와 유사. ❖ 미세번식법의 발전을 위해서는 기내 미세환경의 생태학적, 생태생리학적, 환경 생리학적 및 환경공학적 측면에서 연구할 필요성. ❖ 미세번식을 위한 환경조절 1) 생산비 절감뿐만 아니라 2) 기내 식물체의 생장과 발육이 촉진되고 (생체중, 건물중, 절간의 수, 전체 엽면적, 기내 발근 및 기내 분지 등의 증가) 3) 묘의 투명화와 같은 형태적 생리적 장애의 발생을 줄이며 4) 잎에 큐티클 왁스층이 감소됨을 방지하고 5) 생물학적 오염으로 인한 배양 식물체의 손실등을 감소시켜 주며 6) 생장발육의 균일성이 증가되고 7) 외생 생장조절물질의 지나친 과용을 막아줄 수 있음. 8) 배양과정 중에 환경을 조절해줌으로써 식물체가 기외로 이식된 후 더 빠르고 강한 세력으로 자랄 수 있도록 도와 줄 수 있음. ❖ 식물체들은 배양과정에서 생장에 필요한 탄소원으로는 배지내의 탄수화물이나 공기내의 이산화탄소를 이용. ❖ 배양배지내 존재하는 탄수화물에만 전적으로 의존해서 생장하는 것을 타가 영양, 단순히 광합성에만 의존하는 것을 광자가영양, 탄수화물과 합성 양자에 의존하는 것을 광혼합영양생장이라 함.

9 기내환경 지상부 물리적 환경 지하부 근부 환경 온도 광-광합성 광형태형성 가스조정-탄산가스 산소 수분(습도) 에틸렌 그외 가스
가스확산도(공기 유동) 압력 물리적 환경-온도 수분압-삼투압 압 력 기 질 배지내의 가스와 액체확산도 배지의 경도 화학적 환경-무기물 조성 유기물 조성 pH 용존산소 생물학적 환경-공생미생물 경쟁결합 ❖ 광자가영양생장은 엽록소를 가진 세포, 조직, 기관 또는 식물에서만 일어날 수 있음. ❖ 예전에는 배양중인 절편체와 신초는광합성 능력이 낮고 탄소원과 에너지원으로써 당을 요구하는 것으 로 알려져 왔으나 요즘 연구결과를 보면 엽록소를 가진 절편체나 신초는 비교적 높은 광합성 능력을 가지고 있고 경우에 따라서는 타가영양, 혹은 광혼합영향 상태에서 보다 광자가 영양조건에서 더 빨리 자랄 수 있고 배양중의 물리적, 화학적 환경이 광합성 하기에 적절하게 잘 조절될 수 도 있음. ❖ 배양중에 있는 식물체의 광합성에 관한 연구는 보다 나은 미세번식체계를 발전시키기 위해서 중요할 것으로 보임.

10 기내 미세환경의 특징 ❖ 조직배양은 밀폐된 용기나 가스의 교환이 제한적으로 이루어지는 환경조건하
에서 식물체를 배양하기 때문에 자연상태에 식물체를 재배하는 것과는 큰 차이. ❖ 특히 자연상태에서 광합성 작용에 의해서 탄수화물을 공급 받는 대신에 인위 적으로 배지내 탄소공급원을 첨가하기 때문에 광합성은 상당히 제한된 범위 내에서만 이루어질 뿐 아니라 균일한 온도와 높은 상대습도는 물질이나 에너 지의 유입율이 낮을 수 밖에 없는 특수한 환경을 가짐. ❖ 일반적인 기내 환경 특성 1) 상대습도가 높고 2) 항온 상태로 유지되며 3) 명상태에서는 탄산가스의 농도가 낮고 암상태에서는 증가 4) 배양기간에 따라 에틸렌이 축적 될 수 있고 5) 배지내 당과 무기물 함량이 높으며 6) 배지내 산소 함량이 낮고 배양시기에 따라 페놀 혹은 독성물질이 축적 될 수 있으며 7) 생장조절제가 첨가 경우가 많음. ❖ 배양 용기내에서 생장하는 식물체 1) 증산율이 낮고 2) 광합성율이 낮으며 3) 암호흡률이 높고 4) 수분 및 무기이온의 흡수율이 낮으며 5) 당의 이용율이 낮은 특성을 가지고 있어 결국 생육을 불량하게 만듬.

11 가. 배양용기내 탄산가스 농도의 변화 및 광 ❖ 엽록소가 형성된 식물체를 용기내에서 배양 할 때 명기동안 탄산가스 농도
❖ 엽록소가 형성된 식물체를 용기내에서 배양 할 때 명기동안 탄산가스 농도 는 탄산가스 보상점(50~100umol moㅣ-1 혹은 ppmm)이하로 감소. ❖ 암기동안에는 시간이 지남에 따라 5~10mmol mol-1 까지증가하다가 명기 가 시작되면 다시 100umol moㅣ-1 감소 ❖ 배양병의 마개를 느슨하게 하거나 가스의 교환이 이루어질 수 있는 마개를 이용하더라도 명기 동안에 탄산가스의 농도는 감소하여 대기중의 탄산가스 농도보다 낮음. ❖ 배양식물체의 광보상점보다 높은 광합성 유효광도가 배양용기에 조사될때 명기동안에 탄산가스의 농도가 감소하는 사실로 미루어보아 기내 배양식물 체도 광도만 높여주면 광합성을 하여 광자가영양체로 전환될 수 있음. ❖ 식물체의 생장은 광, 온도, 그리고 습도 등의 환경요인의 영향을 받는데 그 중에서도 광은 유식물체의 생장과 발육에 영향을 미치는 가장 중요한 요인 이라는 것은 이미 잘 알려져 있으며, 식물의 형태형성은 온도, 이산화탄소, 영양뿐만 아니라 광에 의해서 영향을 받음. ❖ 특히 광환경은 잎과 줄기의 크기를 조절할 뿐만 아니라 색소형성과 투명화 에 관여하는 것으로 보임(Debergh et al., 1992). 광질이 생장과 품질에 미치는 영향에 관한 연구는 다양한 작물을 대상으로 많이 수행되었으며 최근에는 발광다이오드(light emitting diode, LED) 광원의 효과가 많은 연구를 통해 확인되고 있음(Lee et al., 2010).

12 ❖ 광질은 식물체의 신초 신장, 잎의 형태 등의 생장 및 형태형성, 그리고 엽록소
합성에 영향을 미친다고 보고됨(Wongnok et al., 2008). ❖ 적색광은 신초와 줄기생장(Shin et al., 2008), 그리고 청색광은 엽록소 합성 (Moreira da Silva and Debergh, 1997)에 중요한 요인이며, 이러한 광질은 식물생장조절제의 농도 변화에 따라 신초 신장이나 측지 발생에 영향을 미침. ❖ 식물조직배양의 광원으로는 형광등이 가장 많이 이용되는데 경제성이나 취급의 용이성, 식물의 생육에 필요한 여러 파장의 방사 등의 특성을 가지고 있기 때문. ❖ 반영구적인 차세대 광원으로 각광 받고있는 LED는 환경친화적이며 광효율이 높고, 수명이 길며 에너지절감 효과가 매우 큰 장점이 있는 광원. ❖ LED는 미세환경을 조절할 수 있는 시스템을 갖춘 식물조직배양실에서 사용하 기에 적합. ❖ LED는 특정 광질을 쉽게 조사할 수 있어 배양기내·외 식물체의 생장 및 형태형 성을 조절할 수 있는 새로운 인공광원의 하나로 주목받고 있으며 국내·외적으로 LED의 실용화에 관한 연구가 활발히 진행되고 있음. ❖  2012년 기내배양 시 광원으로 LED의 파장과 cytokinin이 거베라의 기내 유묘 생육에 미치는 영향을 조사하기 위하여 수행.

13 ❖ 광 ❖ 광도 ❖ 양생식물(sun plant) : ❖ 음생식물(shade plant) :
1) 굴광성(phototropism) : 식물 이 광원을 향해서 자라는 현상 2) 광주기성(photoperiodism) : 일장에 따라 영양생장과 생식생장 조절 3) 광형태형성(photomorphogenes) : 광 파장에 따라 일어나는 현상 ❖ 광도 1) 강광 : 광합성 왕성, 동화물질 생산량 증가로 생장 왕성 2) 약광 : 생장 쇠퇴, 수확량 감소 ❖ 양생식물(sun plant) : 1) 광도 증가 따라 지상부 건물중, 줄기강도, 잎두께 등 증가 2) 줄기의 신장은 억제되고 엽면적 감소 3) 약광에서는 줄기의 길이나 엽면적은 커지지만 도장 4) 개화기나 결실기도 늦어짐 ❖ 음생식물(shade plant) : 1) 광보상점이 낮아 그늘에서도 잘 적응 2) 광포화점 낮아 광도가 증가해도 광합성이 증가하지 않음 3) 오히려 해작용 발생, 생장 불량

14 기내식물의 배양환경 ❖ 기내 배양식물체도 환경 스트레스에 매우 민감한 반응을 나타내는데 스트레스
를 받는 식물체는 포장이식 후 생장이 지연되거나 고사. ❖ 포장이식 후 생존율을 높이고 생장을 촉진시키기 위해서는 배양환경의 조절이 매우 중요 ❖ 기내 배양환경의 불량으로 인해 발생되는 증상 1) 표피왁스의 발달이 불량하거나 기공의 기능이 저하되며 2) 엽록소 함량이 낮고 건물중의 비율이 낮으며 3) 책상 및 해면 세포의 발달이 불량하고 4) 생장이 지연되거나 투명화 같은 생리적 혹은 형태적 비정상개체로 발달되며 5) 잎이나 초장, 형태가 균일하지 안고 변이가 크며 6) 발근이 잘되지 않거나 측근의 발생이 불량한 묘 생산될 수 있음. ❖ 기내 배양환경이 적절하지 못한 조건에서 생산한 식물체를 포장상태에 옮겼을 때 나타나는 반응과 주위할 점 1) 식물체는 수분 결핍에 매우 민감하여 광자가영양체로의 발달이 지연되거나 되지 않음 2) 과다한 증산을 방지하기 위해서 상대습도를 높여주고 차광을 해주어야 함. 3) 위조나 차광으로 인하여 광헙성율이 저하되며, 발근이나 새잎의 전개가 지연 됨.

15 광합성 독립영양 배지 시스템 ❖ 광합성 독립영양 미세번식은 스스로 광합성을 하여 필요한 탄수화물을 생산할 수 있도록 작은 식물의 잎의 엽록소를 이용하여 무당배지(pathogen-free)에서 하는 번식 방법이다. ❖ 그러나 전통적인 배양 방식으로는 광합성 기간동안 작은 CO2 농축이 보여지기에 기내 식물의 광합성은 제한되었다.(Kozai &Iwanami 1988) ❖ Mousseau(1986)는 처음으로 기내 식물이 명확히 광합성 활동을 한다고 결론지었다. 그들은 또한 광합성에서 CO2는 강광도와 함께 꼭 필요한 것이라고 하였다. ❖ Kozai와 많은 이들이(1988) CO2농도와 PPF(photosynthesis photon flux,광합성 광자 유입밀도)의 증대로 배양병과 배지에서 당을 배재한 것에 대한 미세번식에서의 성공적인 발전을 거두었다. ❖ 광을 이용한 미세번식은 기존에 비하여 많은 이점이 있다 ; 이점들은 Kozai와 Zobayed(2000)에 의해 최근 정리되었다

16 광합성 ❖ 타가영양적 미세번식 - 명기동안에 배양병내 CO2의 농도가 감소한다는 것을 처음으로 1978년 보고.
❖ 타가영양적 미세번식 - 명기동안에 배양병내 CO2의 농도가 감소한다는 것을 처음으로 1978년 보고. - 관엽식물의 조직배양시 밀폐된 배양용기 CO2 농도는 명기 개시후 2-3시 간 이내 감소. - 이와 같은 결과는 1) 엽록소를 가진 식물체를 공기순환이 잘 이루어지지 않은 용기내 배양 할 때 광합성을 조사하면 CO2 농도가 감소되는 것으로 보아 광합성이 이루어 진다는 것을 알 수 있으며 2) 명기 동안에 배양병내 CO2 농도의 감소는 광합성을 제한하는 요인이 될 수 있으며 3) CO2 농도가 낮은 조건에서는 광도를 높이더라고 광합성율은 증가되지 않으며 4) 배양 식물체는 배지내 첨가된 당을 이용하여 생장하는 타가영양체나 배지의 당과 부분적인 광합성에 의해 탄수화물을 공급받는 혼합영양체로 생장할 수 밖에 없고 5) 배양병내 CO2 의 농도를 증가시키고 광도를 높여 자가영양체적인 조건하에서 배양 하면 타가 혹은, 혼합영양체 조건하에서 보다 생장이 양호할 것이며 6) 초기 배양절편체로써 엽록소를 함유하고 있는 조직의 면적이 클수록 초기 생장율 을 높일 수 있다는 것을 암시.

17 - 탄산가스 농도를 증가시키고 광도를 높여 배양식물이 충분한 광합성을 할
❖ 자가영양적 미세번식 - 탄산가스 농도를 증가시키고 광도를 높여 배양식물이 충분한 광합성을 할 수 있도록 함으로써 탄수화물을 스스로 공급하게 하는 광자가양양적 미세 번식의 경우 기내 식물체의 광합성에 의한 생장과 발육은, 광, 이산화탄소, 습도, 환기속도, 온도 및 산소등을 포함한 물리적 환경요인에 크게 영향을 받음. -광자가 영양적 미세번식에 미치는 환경의 영향에 대한연구는 많이 보고 됨. - 이 미세번식법은 생산성의 증가와 묘의 품질향상 및 생산비 감소 등 여러 가지 장점을 지님. - 그 장점 1) 기내 배양 식물체의 생장과 발달을 촉진 시킬 수 있음. 2) 식물의 생리적 혹은 형태적 이상을 방지하여 품질을 향상 시킬 수 있음. 3) 증식된 식물체의 개체간 생장 차이를 줄 일수 있음. 4) 발근과 순화과정을 단축 할 수 있고 5) 배지에 첨가되는 유기물, 생장조절제 및 당의 농도를 줄일 수 있고 6) 당이 첨가되지 않은 배지에서도 광자가 영양적 발달이 잘되는 식물체는 당 첨가 에 의한 오염율을 줄이수 있으며 7) 환경조절이 용이 한 큰 배양용기에 대량으로 배양 할 수 있고 8) 자동화, 컴퓨터화 및 로봇화가 용이.

18 ❖ 증산작용 ❖ 광자가 영양적 미세번식법의 단점 - 기내에서 배양하는 식물체는 배지의 화학적 조성이나 물리적 환경의
1) 절편체로 이용되는 저직은 엽록소를 함유하고 있어야만 함. 2) 탄산가스 농도증가에 따른 비용이 증가 3) 광합성이 일어날 수 있는 광도조건을 갖추기 위해서는 추가적이 광원을 설치해야 하며 이로 인하여 발생되는 열을 제거하기 위해서 냉방장치의 용량을 높여야 하므 로 전기소모가 증가. ❖ 증산작용 - 기내에서 배양하는 식물체는 배지의 화학적 조성이나 물리적 환경의 부적합으로 인하여 기능을 상실하거나 제구실을 하지 못하는 기공을 가진 경우가 많으며, 특히 습도가 높고 광도가 낮은 상태에서 자란 식물체 는 표피층이 대단히 빈약. - 기공 저항성은 상대 습도가 낮을 경우 시간이 증가할 수록 증가 - 배양병내 상대습도의 조절은 식물체의 증산율과 광합성 특성에 큰 영향을 미칠 수 있음.

19 환경조절과 생장 ❖ 온도 ❖ 습도 ❖ 주요한 배양병의 이점들 - 대부분의 조직배양식은 주야간 온도 변화 없이 25℃ 유지.
- 국화, 백합같은 화훼류뿐 아니라 거의 모든 식물체의 초장증가와 발달은 주야간 온도 교차에 의해 촉진 될 수 있음. - 플러그묘로 번식시킨 관상용 초화류의 경우에도 주 야간 온도 교차에 의해서 초장을 조절. ❖ 습도 - 용기내의 상대습도나 배지의 삼투포텐셜은 여러 면에서 기내식물체의 생장, 발달 및 광합성에 영향을 미침. - 배양용기내의 높은 습도는 식물체를 연약하게 생장시키거나 투명화를 일으키는 주 원인. - 배양용기가 클 경우에는 용기내의 공기교환의 수가 많으므로 과다한 증산이 일어나 식물체가 쇠약해지 고 마를 수 있으므로 제습기와 가습기를 갖춘 자동습도 조절장치를 사용 하는 것도 효과적. ❖ 주요한 배양병의 이점들 1) 통풍 시스템을 이용한 큰 스케일의 배양병이 작은 배양병에서 보다 상대습도를 작게(>90%)유지 할 수 있다. 2) 기내와 기외의 공기교환 횟수로 CO2 농도와 상대습도를 조절하는 것이 가능하다. 3) 기내에 공기의 흐름을 만들어 기내의 식물에게 긍정적인 효과를 줄 수 있다. 4) 작은 인원으로 식물의 생체중이나 건물중을 줄이지 않고서 몇 백개나 혹은 몇 천개의 상당히 많은 양의 식물을 배양 할 수 있게 한다. 5) 로봇화나 자동화가 가능하다. 6) 식물을 균일하게 배양할 수 있다. 7) 기내에서 식물이 순화하는 능력을 키울 수 있어 기외에서 별도의 순화과정이 필요없다. 8) 성장율을 크게함으로서 증식이나 뿌리생장 cycle을 줄일 수 있다. 기외에서의 순화가 필요없어 생산비를 눈에 띄게 줄일수 있다.