Mmolecular biology 서 늘 한 다영 강 유선.

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1 Mmolecular biology 서 늘 한 다영 강 유선

2 Southern Hybridzation을 이용한 만성 골수성 백혈병의 진단
Index Chapter 21 Southern Hybridzation을 이용한 만성 골수성 백혈병의 진단 검사의 배경 검사 방법 검사의 기술적 고찰

3 서던혼성화란? 서로 상보적인 서열의 단일가닥 DNA가 있을 때, 그것들이 서로 수소결합을 형성하여 이중결합이 되는 것.
여러종류의 서로 다른 DNA가 막 섞여 있는 중에서 내가 원하는 DNA가닥만 찾아내고 싶을 때, 먼저 섞여있는 DNA들을 denatvration (온도를 높이거나 ph, salt농도 등으로 조절해주 면 수소결합이 끊어져 DNA가 외가닥으로 됨)시킴 이것을 nitrocellvlose filter에 붙이는데, gel위에 filter를 놓고 그 위에 tissve를 잔뜩 올려 놓으면, 모세관 현상에 의해 물이 빨려 올라가면서 gel에 있던 DNA조각이 filter에 붙게 됨. filterer radivis tope(방사능)등으로 labeling되어있는 절편 (probe) 우리가 찾고자하는 DNA와 장보적 염기서열을 갖는 짧은 외가닥 DNA절편을 함께 넣고 mix, 후 probe가 짝이 맞는 DNA에 가서 Hybridization (효성화 됨) 이 filter를 x-ray film등에 감괍 >>>>>>> 우리가 찾고자하는 그 DNA 조각이 있는 위치에서만 film이 까맣게 됨.

4 서던블롯팅 전통적인 서던블롯팅은 겔 위로 종이 탑을 쌓아서 겔 속의 DNA가 아래에서 위의 방향으로 움직이게 된다.(8시간 이상의 시간 필요) 사람의 DNA와 같이 특히 큰 길이의 DNA 이동을 용이하게 하기 위해서는 탈 퓨린화라는 과정을 추가한다, 0.25 M HCI에서 10~15분간 방치하면 이중나선 DNA의 염기 중 퓨린 염기와 리보스 결합이 끊어짐으로써 퓨린 염기가 드물지 않게 제거됨. 강염기에 의해 DNA가 변성될 때 염기가 결합되지 않은 리보스의 인산결합이 끊어지게 되어 초기의 길이보다 작은 길이의 단일사슬 DNA가 만들어지고 서던블롯팅에서 이동속도가 빨라지게 되는 것이다. 탈 퓨린화의 시간을 너무 오래 방치하면 너무 많은 염기가 제거되어 혼성화에 영향을 줄 수 있다.

5 만성 골수성 백혈병 (chronic myelocytic leukemia, CML)

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12 4) Genomic DNA의 분리 및 정제 (1)사용시약 -차가운 증류수와 1.8%NaCl
-Phosphate-EDTA butter (PEB) -5%Dextran solution -10%SDS -Proteinase -WBC Lysis -Ethanol (2)WBC의 분리 -Dextran은 긴 탄수화물 중합체로서 RBC들이 서로 엉기게 하여 무겁게 하고 이 때문에 원래의 침강숙도보다 훨씬 빠르게 침전시킨다. 용매의 비중을 높여 주기 때문에 WBC의 침강속도는 느려짐 -방법 1. 10mL 전혈에 3mL의 5% Dextran을 가한 후 혼합한 후 실온에 20분간 세워둠 (적혈구는 침강 백혈구는 혈장 층에 남음) 2. 혈장 층을 조심스럽게 취해 새 투브에 옮김,1000x g, 5분간 원심분리 3.침전물에 6mL의 차가운 증류수를 가하고 20초간 진탕하여 풀고 바로 동량의 차가운 1.8% NaCl을 가하여 혼합함 ( 30초 이상 방치하면 백혈구 파괴, 차갑지 않으면 적혈구 용해 되지 않음)

13 (3)WBC로부터 Genomic DNA의 추출 정제
[1] 3.6ml 백혈구 용해 완충액을 가하여 침전물을 고르게 풀고 바로 0.4ml 10% SDS을 첨 가 (여러 번 역전혼합하여 완전히 섞는다, 거품 나지 않게) [2] Proteinase K를 50㎕ 첨가한 후 혼합하고 55℃에서 3시간 방치 (완전히 섞이도록 오래 혼합, 거품이 나지 않도록 주의) [3] 0.25 vol. 포화 NaCl을 첨가하여 15초간 세게 흔든 후 1500에서 15분 원심 [4] 구멍이 큰 피펫 팁을 이용, 조심스럽게 상층액을 따서 15ml 원뿔 튜브에 옮긴후 2vol 의 찬 에탄올을 넣어 천천히 여러 번 섞으면 DNA침천 [5] 피펫 Tip으로 DNA 침전을 건져내어 70% 에탄올 5ml로 남아 있는 염을 2번 씻어줌 [6] DNA 침전이 붙은 피펫 Tip을 거꾸로 세워두어 공기 중에서 에탄올을 말려 제거 나머지는 -70℃ 냉동 보관 (4)DNA 정량 [1] 멸균 증류수 1ml를 튜브에 담고 blank용으로 두 개 튜브에 같은 멸균 증류수를 담아둠 (DNA 희석용 멸균 증류수와 blank용 멸균 증류수는 같은 병이여야 한다.) [2] 피펫 tip 끝을 잘라 구멍을 크게 한다.tip을 이용하여 증류수를 5㎕ 흡입한다. 멸균 증류수를 버리고 DNA를 취함, 멸균 증류수 튜브에 DNA를 넣고 잘 혼합 (고분자의 DNA는 매우 점도가 높아서 구멍이 큰 TIP을 사용) [3] 멸균 증류수 Blank로260㎚에서 영점을 맞추고 test beam의 큐벳을 멸균 증류수로 씻 은 후 잘 혼합하여 큐벳에 넣고 흡광도를 읽음

14 9) 보고방법 [1] 현상된 필름에 나타난 정상적 밴드와 정상과는 다른 크기의 추가적으로 나타난 밴드의 크기를 계산하여 기록한다. [2] 절단위치 v에서의 재배열은 아직 보고되어 있는 것은 없다.

15 <만성 골수성 백혈병 환자의 서던블롯팅 결과>

16 10) 참고치 : Negative 11) 임상적 의의 -만성 골수성 백혈병을 비롯한 만성 골수증식성 질환의 진단 -급성 림프구성 백혈병의 진단 및 예후의 평가 -급성 및 만성 백혈병에서의 감별진단 -백혈병양 반응 등의 기타 혈액질환에서의 감별진단 -상기 질환의 치료후의 경과관찰 12) 오류발견기준 -각 효소에서의 절단유무가 BCR 유전자내 절단 위치와 맞지 않을 때 -양성 대조가 나오지 않을 때

17 검사의 기술적 고찰 1) 검체의 채취 및 운반 -항응고제를 사용하여 채혈 -채취 즉시 검사실로 운반 -말초혈액의 백혈구는 실온에서 24시간 ( 그 이상이면 WBC파괴되어 DNA가 분해 ) -냉장에 보관된 검체는 WBC는 자신들끼리 응집 (WBC 대부분 소실) -골수천자를 통해 얻어진 검체는 말초혈액보다 더 불안정하기 때문에 채취 즉시 사실 -백혈구를 분리하여 -70℃에 보관하여야 하며 조직은 액체질소에 보관 2) 검체 기록 - 서던블롯팅을 이용한 검사방법 ( 과정이 매우 길고 복잡하여 기록하면서 검사 ) - CLSI(Clinical laboratory standard institute) [1] 환자에 대한 기록: 환자정보 및 검사의뢰의 이유, 검체 채취부위 [2] 검사과정의 기록 : 검체접수 상황, DNA농도, 겔 농도, 전압, 전기영동시간, 대조검체의 변화

18 발병위치 골수

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20 Index Chapter 28 분염법 Q-분염법 C-분염법 G-분염법 R-분염법 NOR-분염법 고해상 분염법 형광탐침법
Spetral Karyotyping

21 1.분엽법이란? 2) 분엽법의 발달사 과거에는 보통의 염색법으로 개개의 염색체와 크기를 구별하기 힘들기 때문에
분염법을 사용하는 목적 핵형분석 (Karyotyping) 하기 위해서는 염색체를 염색하여 염색체의 형태와 크기를 구분해야 함. * 염색체 분석을 위한 세포배양법 1. 소림프구를 이용 2.PHA가 첨가된 배양액을 37도에서 72시간 배양 3.콜히친 또는 김자(Giemsa)염색을 시행 4.현미경관찰 후, 사진을 찍어서 핵형을 제작. 2) 분엽법의 발달사 과거에는 보통의 염색법으로 개개의 염색체와 크기를 구별하기 힘들기 때문에 염색체를 그룹으로 나누어 정의. (같은 크기, 같은 형태의 경우, 외형적으로 동일하게 보임.)

22 3) 분엽법 정의 이 후, 연구자들에 의하여 개개의 염색체 쌍을 식별하기 위하여 염색체의 내부구조의 차이를 국소적으로 각각 다른 색으로 염색하는 특수염색 방법으로 염색체의 크기나 형태만으로 그 염색체 특유의 밴드로 염색해서 나눔으로서 식별하는 방법을 개발. tip. 이때, 염색되는 부분을 염색체 띠(band)라 하고, 몇개의 띠를 모아 영역(region)이라고 함.

23 2.분엽법의 종류 분엽법은 크게 3가지로 일반 분엽법, 부위별 분엽법, 현재 분엽법으로 나뉨 1)일반 분엽법 염색체의 종축방향으로의 구조 분화를 각각 다른색으로 염색하는 방법.

24 Q-분염법(Quinacrine mustard-banding)
원리 : 형광물질의 염색을 이용하여 염기간 서열의 형광밝기를 다르게 나타내어 염 색체표본의 분염양상을 관찰. (일반적으로 형광을 사용하지 않는 G-,R-분염과 연계하여 사용.) 장점 : 염색체의 전처리 과정이 없어 염색체의 모양이 원형대로 보존된 상태에서 관 찰가능 단점 : 형광이 유지되는 시간이 짧고 시료를 사용하기 위해서는 형광현미경과 자외 선 투사가 필요 사용 : 일반적인 염색체 검사, 특히 3번 염색체, 4번 염색체, 아크로 센트릭 염색페, Y염색체의 heteromorphisim을 검사하는 경우 널리 이용. (DNA염기 내 A-T염기가 풍부한 곳은 밝은 형광, C-G염기가 풍부한 곳은 형광이 밝 기가 감소. 즉, 형광의 밝기를 이용하여 염기의 분포정도를 가늠) *g분염과 q분염은 같은 정보를 전달하여, G-분염이 강한 곳은 Q-분염이 약하고, G- 분염이 약한 곳은 Q-분염이 강하다. Q띠법과 G띠법에의한 염색체 띠가 드러나는 방법은 거의 같음

25 (2)G-분염법(Giemsa-banding)
특징 : C-분염을 발전시키다 발견. 원리 : 트립신이나 요소 등에서 전처리하여 김자액으로 염색하는 방법. 그외의 특별한 처리가 필요하지 않음. 장점 1.일시적인 Q분염에 비하여 분염된 것이 영구적이다. 2. 명확하고 깨끗한 해상도로 모든 염색체 이상 진단에 있어서 가장 널리 이용. 3.분염양상의 안정성과 재현성 때문에 가장 유용하고 일반적인 방법으로 이용. (3)R-분엽법(Giemsa reverse banding) 특징 : AT-염기부위은 보다쉽게 열에 변성하고, GC-염기 부위는 온전히 남아있는 특징을 이용한 기술. (G-,Q-분엽법은 반대로 AT 염기부위가 밝은 부위를 나타냄) 즉, G나 Q와는 반대로 염색이 됨. 원리 : g-분엽법에서 고온 처리(87℃)하여 김사 또는 아크리딘 오렌지염색을 하면 R띠를 얻음 사용 : 염색체 말단 끝부분에 관여된 상호전좌나 결실 등을 분석하는데 유용 .

26 (2) T-분엽법 염색체의 말단부위(telomere)만 염색
2)부위별 분엽법(Regional banding method) 염색체의 내부구조분화의 분별염색 (1)C-분엽법 특징 : in situ hybridization 시에 DNA를 변성하는 과정에서 발견. 원리 : 염색체의 동원체(이질염색체)만을 각각 다른 색으로 염색. 1번, 9번, 16번, Y염색체에서 강하게 나타남. 방법 : 알카리와 산을 짧은 시간 전 처리하는 방법 사용 : 염색체의 재배열 또은 역위와 이질염색질 부위 길이의 증가 또는 감소, 같은 염색체 상의 다형성 확인, 표지 염색체들의 성질을 파악하고 체세포 융합연구에서 특정 염색체를 확인하는데 주로 이용 (2) T-분엽법 염색체의 말단부위(telomere)만 염색

27 (3) Nor-분엽법(Nucleolar organizing regions banding). Nor
(3) Nor-분엽법(Nucleolar organizing regions banding) *Nor? 간기에 인을 형성하고 유지하는 특정 염색체 지역. 원리 : 시료를 질산은 처리한 후, 염색체의 위성줄기만 염색하는 방법 즉, 인형성 부위만을 다른 색으로 염색. ->N-분염은 ribosomal cistron의 위치와 일치. 사용 : 개인별로 특이한 양태를 나타내며, 다형성을 밝히는 표지로 이용

28 (2)In situ hybridization 염색체를 확산하여 특이한 DNA 염기배열의 존재 유무를 파악하는데 사용
3)현재 분엽법 고해상 분엽법(high resolution banding technique) *기본적인 염색체 분염 기술은 염색체를 확인하고 구분하기에는 좋지만(주로 , 전기 와 전중기 염색체로 관찰), 중기염색체는 응축이 심하여 비교적 제한된 정보를 제공. 원리 : 세포의 전기, 전중기의 가늘고 긴 염색체에 김자 또는 라이트 염색을 하여 염 색체의 미세한 구조 이상 발견할 핵형분석을 용이하게 하고, 절단점 , 미세한 염색 체 이상의 정확한 지점을 찾는데 도움이 됨. *기다란 염색체 : 더 높은 해상도의 띠, 많은 수의 작은 띠를 보여줌. (2)In situ hybridization 염색체를 확산하여 특이한 DNA 염기배열의 존재 유무를 파악하는데 사용 탐침을 사용하여 염색체에 있는 동종 DNA염기배열을 인식, 부착하는 성질을 이용하여 특정 염색체나 염색체 분절 또는 DNA 염기배열을 알 수 있다

29 (3)형광 탐침법(Fluroescence in situ hubridization,FISH)-중요
* 이 전의 핵형분석에 사용되는 분염법은 흑백의 23개의 염색체 세트를 관찰하는 방법으로, 염색체의 크기와 염색체 번호를 밝히는 방법. 즉, 전위와 같은 염색체 이상성을 정확하게 밝히기에는 부적당. 지난 몇 년 동안 FISH 법은 분자,세포 유전학 분야에서 매우 인기있는 기술로, 세포유전학 사이에 다리를 형성 개념 : 염색체, 세포분열 간기 혹은 중기의 세포 및 조직 절편에서 특정 DNA혹은 RNA의 서열을 검색하는 기법. 원리 : in situ hybridization 의 방법에서 형광탐침을 이용. 특정 DNA배열의 표적 DNA와 혼성화를 시행한 후, 형광으로 그 특정 DNA배열에 관한 정보를 얻어 염색체 이상을 신속하게 진단 *색으로 구분되는 염색방법을 사용함으로써 한눈에 염색체에 다른 색이 섞여 있는 것을 관찰함으로써 이상을 확인.

30 특징 : 세포분열의 중기의 염색체는 물론, 세포분열 간기 세포에서도 결과를 얻을 수 있어, 분열기 세포가 적은 융모막 세포에서 적용할 때 유리. 장점 : 통상적인 세포 유전학 방법에 반해 과정이 비교적 간단하고, 판독이 용이하며, 비용이 덜 들고, 신속한 결과를 얻음. 여러가지 형광을 동시에 사용할수 있어 하나의 간기세포에서 많은 정보를 동시에 얻음 방법 백혈구, 융모 및 양수 내 세포를 이용한 정자를 이용한 FISH법 이용 : 염색채의 수적이상의 검색 염색체 구조적 이상의 검색 미세결손의 검색 marker chromosome 성판정 유전자증폭 유전자 지도작성 chromatin fiber를 이용한 FISH 혹은불활성 X만을 다른 색으로 염색하는 분별염색법 등이 있다. 자매염색분체는 브롬디옥시우리딘 처리와 형광현미경관찰 또는 김사염색으 로 분별염색할 수 있다.

31 Thank you Any Questions?