Gene Cloning.

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1 Gene Cloning

2 Forward genetics and reverse genetics
: from phenotype to gene structure Reverse genetics : from gene to phenotype Mutation Phenotype Gene ~~~~이러한 과정에 의해서 forward genetics와 reverse genetics의 개념이 도입되었습니다. 이 둘의 개념을 집고 넘어가면, 다음과 같습니다. Forward genetics는 식물의 표현형, 즉 돌연변이체에서 유전자를 밝혀내는 과정이고, Reverse genetics는 이와 반대로 이미 sequece의 정보를 알고 있는 상태에서 이 유전자의 표현형을 확인하는 과정입니다. Gene Disruption Mutation Phenotype

3 Forward genetics and reverse genetics
Select a biological process Generate a random and highly redundant mutant population Screen a large number of mutagenized M2 plants Map and clone the mutation Select a gene or genes Generate a collection of mutants or tools Catalogue the mutants in the collection Select mutants in the gene or genes of interest 조금더 자세히 살펴보도록 하겠습니다. Forward genetics의 첫번째 단계는 생물학적으로 차이가 나는 형질을 찾아 내는 것입니다. 이 사진은 3일된 arabidopsis의 seedling사진 입니다. 여기에 암상태를 주었을때와 아니었을때의 환경 변화를 준 것입니다. 왼쪽이 암상태를 주지 않았을 때이고, 암상태를 줬을때의 seedling이 오른쪽입니다. 이 두 seedlign에서 확실한 차이와 함께 morphological인 trait를 확인 할 수 있습니다. 반대로 reverse genetics에서는 sequence를 알고 있는 gene에서 부터 시작합니다. 이 중에서 관심있는 gene을 골라서 시작합니다. 다음단계는 reverse forward genetics 모두 mutant population을 만듭니다. C에서 보면 mutagen 처리를 한 후에 soil에서 발아시킵니다.(이때 family 당 100개체씩 정도) 그럼 M1이 progeny를 생산하게 되면 그 M2를 가지고 phenotypic screen에 사용합니다.d에서는 T DNA mutagenesis를 이용하여 (agrobacterium) 돌연변이를 일으킵니다. 이것들을 배지에서 키우게 되고, T DNA survive에 의해서 저항성을 가진 것만이 살아남게 된다. 각각의 형질전환체 (T1)는 hemizygous하고, 이것을 selfing 하여 segregating population을 만듭니다. 이때 T2 세대를 screening 하는 데 사용합니다. E에서는 전형적인 phenotypic M2 seed의 phenitypic forward genetic screen을 보여줍니다. 저항성에 관련된 것을 쉽게 찾을 수 있다. Reverse genetic screen에서는 t-dna mutant를 가지고 2가지 다른 방법을 사용한다. 이것을 가지고, pcr을 하여 screen을하거나, t2 individual을 가지고, insertion site를 가지고 지도를 그리거나 한다. Insertion 부분을 sequencing 하여 mutant의 gene-indexed catalogue를 안다.? 마지막 단계는 mutant phenotype에 의하여 유전자를 identificaiotn 하는 것입니다. 그림g는 mapping 단계에 대한 것 chromosome level에서 gene 사애로 좁혀간다. Reverse genetics에서의 마지막 단계는 조금더 쉽고 빠르다. Mutant Gene index를 알고 있으면 이것이 흥미 있는 것과 맞는지 search 해본다.,? 이것이 매우 중요한 단계. 즉, 이렇게 phenotype을 보고, 유전자를 찾아가느 것이 frward, 미리 sequence를 알고 시작하는 것이 reverse genetics 입니다. Reverse genetics Alonso et al., 2006

4 About 40% genes identified in the Arabidopsis genome are unclassified.
Whole genome sequence가 밝혀진 arabidopsis나 rice의 경우는 sequence를 알고 시작하기 때문에 reverse gentics가 가능하지만, 아직까지도 sequence정보가 완전히 밝혀지지 않은 작물이 많이 있기때문에 forward genetics를 방법을 많이 사용하고 있습니다. 또한 whole genome sequece가 밝혀진 arabidopsis에서도 forward genetics 방법을 여전히 사용하고 있는데, sequence의 정보는 알아도 그 기능과 분류가 되지 않은 것이 40% 정도 되기때문에 아직까지도 forward genetics 방법을 많이 사용하고 있습니다. 아라비돕시스에서 Functional genomics로 접근 할 수 있는 부분이 40%, 나머지 부분은 정보를 알기 때문에 reverse로 접근 할 수 있다. Forward에 접근하는 방법을 더 넣고.. 이 중에서 map-based.. By Prof. Lee

5 Map-based cloning Positional cloning
Markers linked to the mutated gene Delimiting the region containing the gene of interest The amount of effort required for map-based cloning. 이런 forward genetics에서 유전자르 찾는 방법 중의 하나가 map-based cloning 방법입니다. Map-based cloning 방법은 positional cloning 이라고도 하는데, 그 위를 알고 그것을 기초로 하여 찾아가기 때문입니다. Marker를 mutated gene이나 관심있는 유전자에 위치를 시키고, 유전자지도를 작성하여 이것을 바탕으로 하여 유전자를 찾아가는 방법입니다. 그러나 이 방법에는 많은 노력과 시간이 들어갑니다.

6 Marker identification
Map based cloning Experimental design Mapping population Marker identification genotyping Candidate gene analysis Phenotyping Fine mapping Map-based cloning 실험 과정을 살펴보면 다음과 같습니다. 연구 가치가 있는 mutation이나 표현형질을 찾았다면 가장 먼저 실험 디자인에 의해서 그 목적에 맞게 식물재료를 준비합니다. Mapping population을 만들고, marker를 만들어서 유전자지도를 작성합니다. 원하는 유전자 근처 또는 원하는 유전자에 marker를 위치시켰다면, 마커와 마커간의 거리는 상대적인 것이기 때문에 절대적거리인 물리지도를 이용하여 physical map을 작성합니다. 그러면 이것을 가지고 후보 유전자에 대해서 분석을 합니다. 그리고 후에는 이것이 확실한 유전자인지 확인하기 이해 검증작업을 합니다. 그러면 각각의 과정들에 대해서 자세히 살펴보도록 하겠습니다. Gene confirmation

7 identify a molecular marker that lies close to you gene of interest
The next step is to saturate the region around that original molecular marker with other markers At this point you are looking for a one that rarely shows recombination with your gene

8 The next step is to screen a large insert genomic library (BAC or YAC) with your marker to isolate clones that hybridize to your molecular marker Once you identify the initial markers that map are near (or better yet) flank your gene and found a a clone to which the markers hybridize, you are on your way to determining where that gene resides. The steps that follow are termed chromosomal walking.

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10 This procedure involves creating new markers (usually sequences at the end of the clone) and screening your segregating population with these new markers individuals whenever one allele of your gene is expressed, the markers associated with that allele are also present

11 Marker identification and genotyping
Construction of genetic map 가장 먼저 식물재료인 mapping 집단을 만들게 됩니다. 그 예로 식물 잎에 난 trichome에 대한 것인데요, Trichome에 관여하는 유전자를 밝히고 싶다면 trichome이 많은 것과 trichome이 직은 식물을 교배합니다. 이때의 조건은 이 parents가 homo이어야 합니다. 그리고 이 둘에서 나온 F1은 이 둘의 형질을 반반씩 가지고 있는 형질이 나타나게되고, 유전형도 hetero로 나타납니다. 이것을 selfing하여 세대를 계속 내려서 8세대 이상 내리게 되면 유전형이 섞이게 되면 이것이 바로 recombinant inbred line이 됩니다. 그러면 골고루 형질의 분포가 나타나게 되는데, 이때 형질에 관련해서 genetic marker를 개발합니다. 털이 많은 것을 AA, 털이 적은 것은 aa, 이 두 형질의 중간쯤 되는 것을 Aa, 털이 적은 것을 aa라 하면 이것에 대한 마커를 개발하면 위의 형질을 따라오는 것을 확인할 수 있고, 이것이 확인되면 trichome에 관련된 마커를 개발한 것입니다. A genetic map is constructed on the basis of recombination events between two non-sister chromatids of each pair of homologous chromosomes during meiosis. Mauricio, 2001

12 Genetic mapping Based on the use of genetic techniques to construct maps showing the position of genes and other sequence features on a genome Genetic marekr가 위치하였다면 기뻐할 일이기는 하지만, 이것이 다가 아닙니다. genetic map에서의 마커와 마커사이 거리는 상대적인 위치만 나타낸 것뿐입니다. 그렇기 때문에 물리적인 거리와 위치가 필요합니다. 이때 필요한 것이 physical map인데 physical map을 작성하기위해서는 BAC이나 YAC등으로 이루어진 library가 필요합니다. BAC(Bacterial artificial chromosome) library는 많은 작물에서 이미 물리지도(physical mapping) 작성과 분석을 위해 기본적인 방법으로서 대단히 유용하게 활용되어져 왔습니다. Bendahmane et al., 1997

13 Physical mapping and the identification of candidate sequence
Uses molecular biology techniques to examine DNA molecules directly in order to construct maps showing the positions of sequence features including genes Bacterial artificial chromosome (BAC) library Yeast artificial chromosome (YAC) library Genetic marekr가 위치하였다면 기뻐할 일이기는 하지만, 이것이 다가 아닙니다. genetic map에서의 마커와 마커사이 거리는 상대적인 위치만 나타낸 것뿐입니다. 그렇기 때문에 물리적인 거리와 위치가 필요합니다. 이때 필요한 것이 physical map인데 physical map을 작성하기위해서는 BAC이나 YAC등으로 이루어진 library가 필요합니다. BAC(Bacterial artificial chromosome) library는 많은 작물에서 이미 물리지도(physical mapping) 작성과 분석을 위해 기본적인 방법으로서 대단히 유용하게 활용되어져 왔습니다.

14 Genetic map and physical map
그래서 이 genetic map과 physical map을 연결한 것이 다음과 같습니다. Map based cloning of the VTC2 gene Jander et al., 2002

15 Candidate genes confirmation
The functional experiment of a candidate gene - genetic engineering - overexpressing the target gene - down-regulating the target gene - genetic complementation of a known mutant

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17 Other methods transcriptomics
differential display subtractive hybridisation SAGE Microarray

18 Other methods proteomics
Mass spectrometry 2D gel electrophoresis