벌꿀 중 옥시테트라사이클린 분석 식 품 약 품 분 석 과 윤 설 희.

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1 벌꿀 중 옥시테트라사이클린 분석 식 품 약 품 분 석 과 윤 설 희

2 발 표 순 서 벌꿀 중 옥시테트라사이클린의 규격신설의 배경 HPLC법을 이용한 Oxytetracycline 분석 결 과

3 벌꿀 중 옥시테트라사이클린의 규격신설의 배경
벌꿀에서 항생제 검출 보도 제38호( ) 벌꿀에서 항생제 검출 - 소비자시민모임, 23개 벌꿀 제품의 항생제 및 품질 검사 ■ 검사 결과 요약 벌꿀 제품 일부(56.5%)에서 항생제가 검출되었다. 소비자시민모임이 2006년 5월에서 9월 중순까지 시판되는 23개 벌꿀제품에 대해 항생제 검출 및 품질 검사를 홍콩소비자협회와 공동으로 실시한 결과, 13개 제품에서 항생제가 검출되었다. 품질 검사에 있어서는 8개 제품이 유럽 기준에 미달하였고 이 중 4개 제품은 우리나라 벌꿀의 기준 및 규격에 미달인 것으로 나타났다. ■ 13개 제품 (56.5%)에서 항생제 검출 절반이 넘는 13개 제품 (56.5%)에서 한 가지 이상의 항생제 (항생물질과 합성항균제인 설파제 등)가 검출되었다. 항생제가 검출되지 않은 제품은 모두 10개 제품이었다. • 모든 식품에서 검출되어서는 안 되는 클로람페니콜 검출 : 8개 벌꿀 제품 (35%)에서 식용동물에 사용이 금지된 항생제인 클로람페니콜이 검출되었다. 우리나라에서 클로람페니콜은 소고기, 닭고기, 어류, 돼지고기, 갑각류 등에 검출되어서는 안 되도록 규정하고 있다. 유럽연합에서도 양봉업에 사용을 금지하고 있는 항생제이다. • 한 제품에서 여러 종류의 항생제 검출 : 5개 벌꿀제품에서는 클로람페니콜을 비롯해 퀴노론, 스트렙토마이신, 설파제 등 4가지 이상의 항생제가 검출되기도 하였다.

4 벌꿀 중 옥시테트라사이클린의 규격신설의 배경
꿀벌에서 주로 발생되는 질병 : 부저병, 노제마병, 백묵병 등 양봉업계에서는 세균성질병인 부저병 치료 목적으로 테트라사이클린계 약제를 설탕과 섞어 사용하고 있다. 이러한 항생제를 과다하게 사용 할 경우 최종산물인 벌꿀에 약제가 잔류되어 항생제에 대한 내성의 증가, 알레르기의 유발 등 부작용을 야기할 우려.

5 식품의약품안전청 고시 개정 고시 : 제 2007-26호(2007년 5월7일) 개정이유 주요내용
벌꿀에서 항생물질의 잔류허용기준 규정을 신설하여 국민에게 안전한 식품을 제공하고자 함 주요내용 - 벌꿀 중 옥시테트라싸이클린 잔류허용기준 신설 : 0.3㎎/㎏ 이하 벌꿀 중 옥시테트라싸이클린 시험법 신설 ※ 벌꿀에 대한 동물용의약품의 잔류허용기준 강화 식품의약품안전청고시 제 호( ) - 클로람페니콜(Chloramphenicol) : 불검출( 시행) - 네오마이신(Neomycin) : 0.1㎎/㎏ 이하 ( 시행) - 디히드로스트렙토마이신/스트렙토마이신(Dihydrostreptomycine/streptomycin) : 불검출 ( 시행) - 아미트라즈(Amitraz) : 0.2㎎/㎏ 이하 ( 시행) - 코마포스(Coumaphos) : 0.1 ㎎/㎏ 이하 ( 시행) - 플루메쓰린(Flumethrin) : 0.01㎎/㎏ 이하 ( 시행) - 플루발리네이트(Fluvalinate) : 0.05㎎/㎏ 이하 ( 시행)

6 벌꿀 중 옥시테트라사이클린에 대한 규제현황 Table 1. Maximum residue limits(MRL) of Oxytetracycline in honey EU 칠레 캐나다 호주 대한민국 MRL (㎍/㎏) 25 80 300

7 Oxytetracyclines 그람음성균, 그람양성균 및 마이코플라스마에 대한 정균효과 우수  장내세균 감염증, 호흡기 질병, 아나플라스마 감염증, 타일레리아 감염증 현재 사용되는 항생제 중 치료 및 사료첨가제로 가장 많이 사용

8 Oxytetracycline 분석법 시료전처리법
고체상추출법(Solid Phase Extraction : SPE) : Liquid형태의 시료를 고체상(흡착제)에 흘려주어 용질을 흡착시킨 후 원하는 용질만을 선택적으로 용출시키는 방법 액상추출법(Liquid-Liquid Extration) : 화합물의 용해도 차이를 이용하여 액상의 추출용매에서 유기용매층으로 전이시켜 추출하는 방법으로 유기용매의 사용량의 많으나 시료를 다량 사용하여 농축할 경우 미량도 검출해 낼 수 있다. 시료고체상 분산처리법(Matrix Solid Phase Dispersion : MSPD) : 시료와 고체상인 분말을 직접 갈아서 반응시킨 후 유리컬럼에 옮겨 탈지하고 적합한 용출용매로 원하는 물질을 용출시키는 방법으로 유기용매의 사용량이 적고 방법이 간단하고 처리시간이 짧다는 장점이 있으나 시료의 양이 적어 액상 추출법에 비해 극미량은 검출하기 힘들어 스크리닝 방법으로 적당하다

9 Oxytetracycline 분석법 정량법 High performance liquid chromatography(HPLC)
: 식품공전상 정량법 Capillary high performance liquid chromatography High performance liquid chromatography-mass spectrometry(HPLC-MS)

10 HPLC 법을 이용한 정량검사 측정기기 : 액체크로마토그래피/자외부흡광광도검출기 시약 및 시액
- 표준용액 조제 : Oxytetracycline(OTC) 표준품을 정밀히 달아 메탄올에 녹여 표준원액(Stock Solution- 100㎍/㎖)을 만들어 적당한 농도로 희석하여 사용. - 맥바인 완충용액 : 구연산 11.8g + EDTA·2Na 33.62g + 제이인 산나트륨 13.72g⇒ 증류수 1ℓ에 녹임. - HLB(Hydrophilic Lipophilic Balance) Cartridge : 역상흡수제

11 HPLC 법을 이용한 정량검사 시험용액 조제 Inject into HPLC ▶ 정제 ▶ 정제 ① HLB카트리지 :
잔류물은 메탄올 2㎖에 녹인 후 Filter with 0.2㎛ membrain filter ▶ 정제 ① HLB카트리지 : Pretreatment with methanol 8㎖, DW 8㎖=>활성화 ▶ 추출 Sample 5g + 20% 삼염화초산 2㎖+ McIlvain완충용액 20㎖ ⇒ 원심분리하여 상등액 여과 추출 Inject into HPLC ▶ 정제 40℃이하의 수욕중에서 감압농축 ▶ 정제 ② absorption of Extrat solution ③ Washing with 5% Methanol ④ Elution with 0.01M Oxlic Acid-Methanol

12 Table 1. Analytical conditions for High performance liquid chromatography
HPLC Dionex UVD 170U Column Capcellpak C18(4.6*250mm, 5㎛) Detector UV Wave Length 365nm Mobile phase Injection volume 10ul Flow rate 1.0 ml/min 0.01M Oxalic acid ACN 구성비(%) 80 20

13 Figure 1. Chromatogram of Oxytetracycline standards (1 mg/kg)
결 과 1. HPLC 크로마토그램 Mobile Phase 0.01M Oxalic acid : ACN = 80 : 20 Flow rate 1.0ml/min Figure 1. Chromatogram of Oxytetracycline standards (1 mg/kg)

14 Figure 2. Chromatogram of five Oxytetracycline standards
결 과 2. HPLC 의 농도별 표준곡선 Figure 2. Chromatogram of five Oxytetracycline standards

15 결 과 2. HPLC 의 농도별 표준곡선 Fig3. Standard calibration Curves
결 과 2. HPLC 의 농도별 표준곡선 : 표준용액을 각각 0.5 ~ 10㎎/kg의 농도범위에서 HPLC에 주입하여 자외선 검출기로 측정하였을때 상관계수 0.999이상의 양호한 직선성을 나타냄 (Fig.3). Fig3. Standard calibration Curves

16 Figure 4. Chromatogram of Oxytetracycline in spiked honey
결 과 3. Recovery of Oxytetracycline in spiked honey Sample 1 mg/kg 2 mg/kg 4mg/kg Figure 4. Chromatogram of Oxytetracycline in spiked honey

17 Recovery rate(%, mean ±S.D.), n=3
결 과 3. Recovery of Oxytetracycline in spiked honey Table2. Recovery rate of Oxytetracycline in spiked honey Recovery rate(%, mean ±S.D.), n=3 1 ㎎/kg 2 ㎎/kg 4 ㎎/kg Mean Oxytetracycline 84.2±7.3 108.3±2.0 106.3±4.4 99.6±6.8 ※ S.D. : Standard deviation

18 결 과 4. 벌꿀 중 옥시테트라사이클린계 약제 잔류 0.01㎎/kg 검출.
결 과 4. 벌꿀 중 옥시테트라사이클린계 약제 잔류 : 9월 수거식품 벌꿀 11개제품 중 2개의 제품(20%)에서 0.01㎎/kg 검출.

19 감 사 합 니 다.