조직의 고정.

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1 조직의 고정

2 고정의 목적 1) autolysis [자가융해]의 방지 (가수분해 효소를 불활성화) 2) 화학물질의 용해 및 소실방지
(hardening : 유동성인 원형질의 반고체화, sol → gel) 3) 미생물에 의한 부패방지 (killing : 살해, 세포의 기능을 정지) 4) 조직손상의 방지 5) 매염작용 (염색단계에서 염색을 잘 되게 하는 작용)

3 고정제의 분류 그림 4-3. 고정제의 분류

4 포름알데하이드 (formaldehyde , HCHO)
Formalin : formaldehyde solution 100% formalin은 강한 자극성인 무색의 formaldehyde gas 37~40%가 물에 녹아있는 상태 *100% Formalin: 37~40% formaldehyde * 10% formalin: 3.7% ~ 4% formaldehyde

5 메틸렌가교: 부가 & 축합 반응 그림 4-6. 메틸렌 가교형성. 포름알데히드와 단백질 아미노기 사이의 메틸렌 가교

6 포르말린 색소 (formalin pigment)

7 산성화된 포르말린의 중화제: lithium carbonate(탄산리튬), sodium carbonate, calcium carbonate, magnesium carbonate 등 10% 인산완충액 (neutral buffered formalin:NBF)을 사용

8 Formalin 색소의 제거 Kardasewitch 법
70% ethyl alcohol 100ml에 Conc. ammonia water를 1ml 섞어 10분 이상 처리하여 제거 Verocay 법 80% alcohol 100ml + 1% potassium hydroxide (수산화칼륨) 1ml를 섞은 용액에서 제거 Lillie 법 Aceton 50ml + 3% H2O2 + conc. ammonia water를 1ml 섞어 처리하고 70% alcohol 에 수세한 후 흐르는 물에 수세 Picric acid 법 100~70% alcohol에 수세 후 absolute ethanol + saturated picric acid 에 2시간 처리

9 살균력이 있어 방부제로도 이용되며 값이 싸고 조직 내 침투력이 강하며 고정이 양호하여 조직병리 분야에서 가장 널리 사용하는 고정액
공기중의 산소(O2)나 빛에 의해 산화되어 formaldehyde로부터 포름산(formic acid)이 발생할 수 있어서 산화되므로 이를 방지하기 위해서는 산화방지제를 첨가 미세구조의 보존 상태가 좋지 않기 때문에 전자현미경검사에는 부적당 조직침투력은 실온에서 1시간에 약 1mm 정도이며, 가온 및 진탕 시는 고정이 촉진

10 100%

11 Glutaraldehyde molecule의 각 끝부분에 하나의 aldehyde group 이 붙어있는 dialdehyde 인 점이 formaldehyde 와의 차이 penetrates slowly and pooly 전자현미경을 위한 고정에 주로 이용되며, 그것은 다른 aldehydes 보다 미세구조의 보존에 좋기 때문 periodic acid- Schiff (PAS) stain과 같은 Schiff reagent를 이용하는 염색에는 glutaraldehyde-fixed은 false-positive를 얻을 수 있기 때문에 이용하여서는 안된다.

12 그림 4-9. 글루탈알데히드와 단백질 아미노기 사이의 교차결합

13 Osmium tetroxide (OSO4)
Osmiun계 고정액 Osmium tetroxide (OSO4) glutaldehyde와 함께 전자현미경을 위한 후 고정액 (2차 고정액, postfixative) 으로 주로 사용 복합지질, 지방 등을 잘 고정하며 이 물질에 산화되면 검은색으로 나타난다.

14 불포화지질과 결합하여 지질이 지용제에 녹지 않게 된다
장점 전자 현미경 검사를 위한 조직의 고정 및 지질의 고정 단점 값이 비싸며 침투가 느리고 조직을 검게 착색하므로 대조염색을 하기가 어렵다. 독성이 강하기 때문에 환기장치가 잘된 장소에서 취급 종류 Flemming solution 2% Osmium tetroxide + 1% Chromium trioxide + Glacial acetic acid 12~24시간 고정하고 물에 수세한 다음 80% alcohol에 보관

15 Picric acid (피크린산) 고정제와 염색에 모두 사용되는 유일한 물질
DNA는 가수분해시키는 강한 산성물질이므로 DNA and RNA를 염색할 때는 picric acid 가 첨가된 고정액은 피하라. 조직의 침투가 느리며, 세포를 심하게 위축시키기 때문에 단독 고정액으로 사용하지 않고 세포를 팽창시키는 glacial acetic acid와 혼합하여 사용 소량의 석회 침착의 탈회 효과 포화 수용액 상태로 사용

16 Picric acid (피크린산)이 포함된 복합고정액
Bouin, Rossmann, Duboscque-Brazil solution 등 고정된 조직은 황색을 띠어 염색을 방해 → lithium carbonate를 70% alcohol에 포화시킨 용액으로 처리

17 Picric acid계 고정액 종류 Bouin solution : Picric acid 포화 수용액 + 40% formalin + Glacial acetic acid ⇒ picric acid는 조직을 수축시키기 때문에 조직을 팽창시키는 acetic acid 와 함께 사용 ⇒ acetic acid 로 인해 적혈구는 용해 ⇒ excellent for trichrome stain Dubosque-Brazil (D.B) solution : 80% ethanol + 40% formalin + picric acid ⇒ 신장의 침생검의 고정에 우수

18 Picric acid계 고정액 장점 Masson's trichrome 등의 염색에 우수 단점 적혈구를 용해
DNA의 증명에 사용되는 Feulgen 반응에는 핵단백질이 가수분해되기 때문에 절대 금물

19 Mercuric chloride (승홍, 염화 제2수은,HgCl2) 유독성 및 금속 부식성의 백색 결정체
중금속 고정제 중 가장 많이 사용 Mercuric ion은 주로 단백질의 carboxyl group과 결합 승홍이 포함된 복합고정액 Zenker’s, Helly, Heidenhain susa, B5 solution, Maximow 등

20 장점 경색 또는 울혈이 발생한 조직 및 비장과 같이 혈액이 풍부한 조직의 고정에 우수 매우 강한 단백질의 고정과 매염작용으로 인한 염색성의 증가 단점 금속을 부식하는 성질이 있으므로 금속제 기구의 사용을 금한다. 조직이 심하게 위축되므로 대부분의 빙초산을 첨가 동결절편의 제작이 어려우며, 고정후의 조직에 흑색 침전물이 침착 오랜 시간 고정 시 조직이 상당히 경화되는 작용이 있어 비교적 작은 조직편의 고정에 사용

21 종류 Zenker solution Potassium dichromate + Sodium sulfate + Mercuric chloride + D.W. 사용 직전 Zenker 원액 95ml에 빙초산 5ml를 첨가하여 사용 고정 후에는 반드시 mercury pigment를 처리 Helly solution Zenker 원액 + Formalin 37~40% Heidenhain 'Susa" solution B-5 용액

22 승홍 색소의 제거 (탈승홍, 옥도화과정, 요오도화과정)
승홍으로 고정한 조직표본은 수은성의 침전물인 금속성 수은(HgCl)이 결정상 작은 흑색과립형태로 나타나는데 이는 염색 전에, 1) Lugol's iodine(요오드액): 수은제거 2) 5% sodium thiosulfate (티오황산나트륨수용액) : 남은 요오드를 제거 Mercuric pigment

23 Alcohol계 고정액 고정액으로서 에탄올은 95~100%를 사용 조직화학용 고정제로서 우수
조직세포의 구조 보존이 좋지 않아 세포질이 변형 또는 위축→다른 고정제와 혼합이용 ex) 포말에탄올, Carnoy sol. 메탄올 : 혈액도말표본 고정에 사용

24 Acetone (CH3COCH3) enzyme 특히 효소 (acid and alkaline phosphatase)를 조직학적으로 증명할 때 사용 냉장온도 (cold aceton [0~4℃])에서 고정(동결절편 고정에 유리)하여야 하며 동시에 탈수도 이루어지므로 총 고정과 조직처리 시간은 많이 감소 매우 빠른 고정 작용을 보이나 심하게 shrinkage, distortion, overhardness에 주의

25 Ethanol (ethyl alcohol)
water-soluble 조직의 구성요소 (glycogen, urate crystal 등)의 보존에 이용 fat을 용해 조직을 경화와 수축 (단백질이 응고되고 조직의 침투가 빠르지만, alcohol의 농도에 비례하여 조직의 경화 및 위축 발생) Alcohol에 고정하면 고정과 동시에 탈수되기 때문에 탈수과정이 필요 없다.

26 장점 RNA나 당원(glycogen) 등을 2시간 이내에 탈수 및 고정 단점 너무 오래 고정하면 조직이 심하게 위축 지질이 용해되므로 항산성 간균이나 수초(myelin)의 증명에 사용할 수 없다. 종류 Carnoy’s solution : Absolute alcohol + Chloroform + Glacial acetic acid ⇒ 빠른 고정작용, 당원의 보존과 핵의 보존에 좋다.

27 고정의 형태 1) 화학적 고정 침수고정 (immersion fixation, 담금고정) 고정액에 조직을 침수시켜 단백질을 변성
대부분의 조직은 이 방법에 의해 고정 관류고정(perfusion fixation) 고정액의 침투속도가 느린 경우 고안 조직괴 내부도 균일하게 고정을 유도 특수한 장기, 뇌, 췌장 등은 관류고정 자주 사용되는 관류고정액: 4% glutaraldehyde 인산염 완충액 관류 시간: 생체나 그 국소부위의 크기에 따라 다르지만 보통 5~20분이 적당 고정의 형태

28 관류고정(perfusion fixation)

29 주입고정 (infusion fixation)
폐와 같이 공기가 들어 있는 장기를 고정 (주로 주사기 사용)

30 증기고정 (vapor fixation) 신선한 조직 속의 가용성 물질이 물 또는 유기용매 등에 접촉하기 전에 그것을 불용성 산물로 변화시켜 존재위치가 이동되지 않도록 고정하기 위해 휘발성 고정제를 증기 형태로 조직에 작용시켜 고정하는 방법 formaldehyde, glutaraldehyde, acrolein, osmic acid, ethanol 등 Formaldehyde와 paraformaldehyde는 50~80℃, acrolein은 50~60℃, 오스뮴산은 37℃, 에탄올은 50~60℃에서 2~5시간 고정

31 2) 물리적 고정 가열법 동결법 약품을 사용하지 않고 단백질을 불활성화 시키는 방식 자가융해를 촉진시키기 때문에 사용되지 않음
자가융해를 촉진시키기 때문에 사용되지 않음 동결법 일시적인 단백질의 활성을 정지시켜 조직의 사후변성을 방지하고, 포매효과는 물론 조직을 가능한 생체 상태에 가장 가깝게 보존하는 효과

32 극초단파법 (microwave fixation)
고정액이 조직이나 세포에 신속히 침투 면역항원성의 유지에 좋아 면역조직화학 염색에 좋다. 수술 시 신속표본 제작에도 활용 한번에 커다란 조직을 단시간에 고정 조직괴의 크기에 따라 몇 초 또는 몇 분 이내로 가능하기 때문에 전자 현미경 검체의 표본제작에 효과적 조직의 등전점의 변화로 인해 eosin이 과염되며, 표준화하기가 쉽지 않다

33 고정에 영향을 미치는 요소 Penetration(고정액의 침투율) 열에 의해 영향을 받음.
고정액의 농도에 의해서는 영향을 미치지 않는다. Size(조직의 크기(두께)) 광학현미경용 조직의 두께는 4mm 이하 전자현미경용 조직의 두께는 0.5~1mm 또는 그 이하 Temperature(고정 시 온도) 일반 조직검체의 경우 실온(18~24℃)에서 고정 전자현미경 검사와 조직화학적 검사(조직내 효소의 증명) 시 4℃에서 고정 고정에 영향을 미치는 요소

34 Time(고정 시간) 고정액의 pH Osmolality(고정액의 삼투압)
짧으면 고정이 불충분하여 고정 이후 과정에서 조직세포 구조가 손상 또는 파괴되고 조직화학적 반응도 약화 고정액의 pH 광학현미경에서는 중요하지 않다. 전자현미경에서는 매우 중요 조직은 일반적으로 pH6~8의 중성 상태에서 가장 안전하게 고정 Osmolality(고정액의 삼투압) 조직의 평균 삼투압은 340 mOsm light microscopic studies에서는 중요치 않다.

35 특수고정액 전자현미경을 위한 고정액 박물표본을 위한 고정액 Kaiserling solution
전고정제로서 2% glutaldehyde (pH 7.2~7.4), 후고정제로 서 1~2% Osmium tetroxide 용액 박물표본을 위한 고정액 Kaiserling solution Kaiserling Ⅰ고정에 1~5일간 고정하고 Ⅱ액에 1~6시간 두어 원래의 조직의 색을 재현시킨 후 Ⅲ액으로 옮기면 영구히 마르지도 않고 변하지도 않는다(본래의 색 유지). 전시용 박물표본(museum preparation)을 제작하여 영구보존 해야 할 경우 특수고정액

36 고정의 실제 고정 용기 고정액의 양 고정의 촉진 고정시간 입구가 넓은 용기
작은 조직편의 고정에는 눈에 잘 띠도록 투명한 용기 사용 고정액의 양 조직 용적의 10~30배(대략 15배)가 되도록 충분하게 고정의 촉진 고정액의 침투를 빠르게 하기 위해, 진탕, 감압하에서 고정 고정시간 Formalin 고정의 경우; 작은 생검검체 : 수 시간에서 12시간 두께가 5mm 이상: 24시간 정도 고정 고정의 실제

37 조직편의 취급 고정의 완료 고정 후 처리 고정 후 조직의 용적 변화 조직편의 두께는 보통 4mm 이하
조직의 색상 및 경도의 변화 고정 후 처리 포르말린은 고정 후 보존액의 기능도 있기 때문에 고정이 끝난 조직을 당분간 그대로 보존해도 좋다 고정 후 조직의 용적 변화 조직과정을 거쳐 paraffin으로 포매할 때 본래 용적의 약 33%가 위축

38 수세(washing) 고정액의 주성분과 formalin pigment(색소)를 제거
고정액에 의해 형성된 인공산물 (조직내 산 또는 알칼리 성분)을 제거 고정 후 조직 내에 남아 있는 고정액은 조직과정을 방해하는데 이를 제거하기 위해서는 흐르는 물에 충분히 수세 Alcohol액에 고정한 조직은 수세 할 필요가 없다. 수세(washing)

39 수세의 과정 조직이나 고유번호가 적힌 인식레이블의 유실을 방지하기 위해서 tissue capsuling을 한 후 금속바구니에 넣어 흐르는 물에 방치, 또는 유리병(cup)이나, beaker 등의 입이 넓은 용기의 입을 거즈로 싸서 흐르는 물을 통과 tissue capsule의 구멍을 빠져 나갈 만한 작은 조직(내시경 조직)은 거즈로 싼 후 tissue capsule에 넣어야 안전 시간은 12~24시간이나 10% 인산염 완충 중성 formalin을 사용하는 검사실에서 임상환자를 대상으로 할 때는 진단을 빨리 하기 위해 보통 2~4시간 정도

40 고정의 실제 고정액의 양은 조직크기에 따라 15배 정도

41 Improper fixation -spleen Improper fixation –liver(autolysis)