제6장 효소의 생산, 추출 및 정제.

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1 제6장 효소의 생산, 추출 및 정제

2 효소 정제의 필요성 식품내 저해제가 함께 존재하면 효소 정제 바람직 효소를 고정화하여 사용하고자 하는 경우
식품내 어떤 성분을 분석하는 경우 효소반응 기작(mechanism)을 정확히 이해하고자 경우 신약 개발시 저해물질이 효소반응을 방해하는가 유무 확인 단백질분해효소가 함께 존재하는 경우 효소의 특성을 파악하고자 하는 경우

3 효소 확보를 위한 제언 효소가 많이 함유된 소스를 선택 (시간적, 공간적 제한이 없는 경우)
분리 정제과정에서 불활성화 물질이 없어야 함 (페놀 화합물이 많이 존재하는 경우) 미생물의 경우: 성장 배지의 조성을 달리해 줌으로써 효소의 양을 증가시킬 수 있는 환경조건 (pH, 온도, 교반조건, 무기염류, 산소농도 등)을 달리 유도 유도물질의 첨가

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6 효소 정제시 요구 조건 냉장에서 실험: 대부분의 효소들은 0°C 부근에서 더욱 안정 미생물의 성장도 지연.
단백질 분해효소와 함께 존재시 단백질 분해효소들에 의하여 단백질 분해작용 정제 작업을 저온(4oC 이하)에서 가능한 빨리 완충용액 사용: 핵산, 유기산의 유출로 pH가 변화 효소 보호 차원에서

7 효소 - 세포외 효소(extracellular enzyme) - 세포내 효소(intracellular enzyme)
세포막 파괴가 요구.

8 세포막 파괴 방법 Waring 혼합기에서 균질화 Potter-Elvejhem 균질기
Wiley 맷돌을 이용: 아세톤 가루/ 액체 질소 사용 모래(sea sand)와 함께 갈아줌 유리 조각을 갖고 있는 Waring 혼합기에서 균질화 음의 진동 또는 초음파(ultrasound) 이용 고압하에서 작은 구멍을 통해 통과

9 subunit로 구성된 단백질의 경우 SDS에 의하여 수소결합이나 소수성 결합이 끊어져 이를 subunit 단위로 분리
PAGE 전기영동 : 효소단백질 분리는 분자의 전하 밀도, 전하 분포, 형태, 크기에 의해 이루어짐. 효소단백질이 가지는 단위 무게당 전하 밀도는 하나의 효소단백질을 분리하는데 중요한 수단이 됨 용액의 pH에 따라 알짜 전하가 변화하여 이동도(mobility)에 영향미침. SDS 전기영동 : subunit로 구성된 단백질의 경우 SDS에 의하여 수소결합이나 소수성 결합이 끊어져 이를 subunit 단위로 분리 많은 음전하가 결합하여 알짜 전하에 의하여 이동도가 결정되는 것이 아니라 분자량에 의하여 이동도가 결정 Subunit을 구성하고 있지 않은 단백질의 경우 분자량에 따라 구분이 되어짐.

10 전기영동에서의 pH 선택 (순수 분리되었는지 여부를 확인) 전기영동에서의 pH 선택

11 [예제] 다음의 효소들을 전기영동을 행하면 밴드의 순서가 어떤 순서로 예상되나?
효소 A: MW = 34,000 pI = 효소 B: MW = 45,000 pI = 5.4 효소 C: MW = 68,000 pI = 효소 D: MW = 65,000 pI = 9.3 SDS-gel 전기영동 polyacrylamide gel 전기영동

12 SDS 전기영동에 의한 분자량 계산 (순수 분리되었는지 여부를 확인) SDS 겔 전기영동
SDS 겔 전기영동 은 sodium dodecyl sulfate를 충분히 첨가하여 전하에 의한 차이를 최소화하고 대신 분자량에 따라 분리 하는 방법이다. 분자량이 큰 것은 그만큼 이동시 저항을 많이 받게 되며 분자량이 적은 것은 저항을 적게 받아 빠르게 이동되는 효과를 보여 준다. 이러한 이동도와 분자량의 Log값으로부터 분자량을 예상하는 것이 가능하다 SDS 전기영동에 의한 분자량 계산 (순수 분리되었는지 여부를 확인)

13 정제방법의 선택 (어느 방법, 어떤 순서 등 ) 염용액 첨가 pH안정성에 따라 분리 (-)를 띤 CM-cellulose 컬럼
황산암모니움 침전 Sephadex G-75에서 겔 여과법 냉동 건조해 분말화. 염용액 첨가 열안정성에 따라 분리 Sephacryl S-300에서 겔 여과법 (-)를 띤 CM-cellulose 컬럼 SDS 전기영동 Chromatofocusing 냉동 건조해 분말화. 염용액 첨가 황산암모니움 침전 열안정성에 따라 분리 (+)를 띤 DEAE-cellulose 컬럼 Affinity chromatography SDS 전기영동 냉동 건조해 분말화.

14 정제방법의 예 돼지근육에서 adenylate kinase의 분리
믹서로 마쇄한 돼지 근육에 염용액 첨가해 근육으로부터 효소를 분리 KCl은 이온교환 크로마토그래피에서 NaCl 농도구배로 흡착된 효소를 용출시키는 것 과 마찬가지 효과 추출물의 pH를 조정하여 pH안정성에 따라 분리 원심분리해서 변성된 단백질 침전물을 제거 (-)를 띤 phosphocellulose 컬럼에 흡착, 염 농도구배로 흡착된 효소 용출 이물질을 제거하기 위해 황산암모니움을 처리해 효소를 침전 침전물을 Sephadex G-75에서 겔 여과법으로 분리 보강을 위해 황산암모니움을 넣어주거나 냉동 건조해 분말화.

15 순수하게 분리되었는지 여부 확인 전기영동에 의해 단백질 밴드가 1개 나타나면 일단 순수하게 분리되었다고 봄.
Densitometry로 확인 2. 각 분획별로 비활성도(specific activity)가 일정하 면 순수하게 분리되었다고. 3. Isoelectrofocusing 에서 단일밴드 여부

16 단백질 정량 상대적으로 신속, 정확하며 가능하며 분석에 너무 많은 시료가 사용되지 않는 방법을 선택.
켈달법(Kjeldahl method) 2. 뷰렛법(Biuret method) 3. 로우리법(Lowry Method) 4. 분광광도법(Spectrophotometric method) 5. 브라드포드 방법(Bradford method) 6. Bicinchoninic acid (BCA)방법

17 비활성도(Specific activity): (unit/mL)/(mg protein/mL)
(Specific activity) i th 단계 정제도(Purification fold) = (Specific activity) 1 st 단계 (Total activity) i th 단계 수율(Yield) = x 100 (%) (Total activity) 1 st 단계