독성학의 분자 - 생화학적 원리 ( 독성시험 해석에서의 응용 ) 대구가톨릭대학교 GLP 센터 박영철

1. 독성학의 분자 - 생화학적 원리 : 저술계기 ○ 저술계기 : ① 대부분의 독성학과 관련 서적이 공저이며 일관적인 원리를 통한 전체 흐름 파악의 어려움 : 유기물질의 독성기전에 대한 핵심적 원리 : Central dogma 제 시와 기전 설명 ② 독성시험의 결과에 대한 일률적인 최종보고서 : 독 성시험의 종합적 해석 부족 ③ GLP-based 독성시험에 대한 독성해석론의 기초

※ 독성시험의 중요성 : 독성시험으로 인한 신약 개발 실패율을 줄일 수 있는 방안은 무엇일까 ?

2. 독성학의 분자 - 생화학적 원리의 핵심 (Central dogma 를 통한 독성기전 이해 ) ○ 유기물질의 " 독성학의 시작과 끝은 toxicokinetic 와 toxicokinetics" 이라는 개념으로 "Central dogma" 개발

3. Direct-acting vs indirect-acting toxicants

3-1. Direct-acting vs indirect-acting toxicants ( 직접 - 작용 및 간접 - 작용 독성물질 ) ○ 생체전환 (biotransformation): 약물 등이 체외 배출을 위해 Phase I 과 Phase II 의 효소작용으로 친 수성대사체 로 전환되는 과정 ○ 직접 - 작용 독성물질 : 생체전환 과정이 없이 원물질 (parent compound) 자체 또는 자연분해 (natural decomposition) 를 통해 독성을 유발하는 물질 : 활성형물질 (active form 또는 reactive form): ○ 간접 - 작용 독성물질 : 생체전환을 통해 활성을 띠는 대사체를 활성중간대사체 (reactive intermediates) 이라고 하며 이들의 생성을 통해 독성을 유발하는 물질 :

3-2. 직접작용 및 간접작용 독성물질과 GLP- 독성시험 해석 ◎ 단회투여독성시험에서 왜 시험물질 투여 후 거의 시간단위로 개체의 사망 여부를 관찰할까 ? ○ Direct-acting toxicant: 빠르면 1 시간 이내 24 시간이내 독성 증상 및 사망을 유발할 경우에 direct-acting toxicant 일 가능성 높음. 유기독성물질의 10-20%. 예 ) tetrodotoxin( 복어독 ). ○ Indirect-acting toxicant: 독성반응을 나타내기 위해서는 생체전환 (biotransformation) 에 의한 생체활성화 (bioactivation or metabolic activation) 가 필요. 이로 인하여 독 성을 유발할 시간이 요구되는데 독성반응이 짧게는 48 시간 길게는 돌연변이와 발 암을 유도할 정도의 장기간이 소요. 유기독성물질의 80-90%. 대부분의 발암물질.

3-2. 직접작용 및 간접작용 독성물질과 GLP- 독성시험 해석 ○ 따라서 단회투여독성시험에서 사망이 초래되면 시험물질은 대부분 직접 - 작용 독성물질로 추정할 수 있다. 직접 - 작용 독 성물질에 의한 사망은 심근계통의 근육계, 신경계 또는 세포 괴사 (necrosis) 에 기인할 가능성이 높다.

4. Biotransformation( 생체전환 ): Phase I 과 Phase II

4-1) Biotransformation 의 개념과 구성 ○ Biotransformation 은 Phase I( 제 1 상반응 ) 과 Phase II( 제 2 상반응 ) 을 반응을 통 해 흡수 → 배출을 위한 xenobiotic( 외인성물질 ) 의 화학적 특성 변화 ○ 영양물질은 최종산물이 CO2 이지만 biotransformation 를 거치는 외인성물질은 원물질에 가까운 대사체 ○ Biotransformation 과정은 친수성대사체뿐 아니라 체내 4 대거대분자와 결합을 통해 독성대사체도 생성하기에 물질의 독성기전에 있어서 가장 중요한 부분

4-2) Biotranformation Phase I 의 핵심은 Cytochrome 450 ◎ P450 은 Phase I 반응에서 핵심효소이며 체내로 들어오는 외인성물질의 75% 이상을 생 체전환를 유도한다 ( 그림 A). P450 은 사람에게 57 종이 있으며 이중 15 종류가 외인성물질의 생체전환을 관여하며 5 종류가 95% 이상의 외인성물질에 생체전환을 유도한다 ( 그림 B).

◎ Cytochrome 450 활성의 예 : CYP2E1 과 에탄올 ○ Cytochrome P450 의 유도와 분해시간 - 유도물질 노출 후 Cytochrome P450 유전자로부터 발현 시간 : 약 4-24 시간 - Cytochrome P450 의 반감기 : 약 48 시간

4-3) Cytochrome P450 활성은 양날의 칼 ? 첫째 이유 :

○ 유전독성시험에서 이론적으로 약 90% 가 metabolic activation 에 의한 독성대사체 ( 또는 활성중간대사체 ) 생성에 의해 DNA 손상을 유발. 이는 다른 독성시험에서의 결과도 연관 하여 해석이 가능 즉 만성적 독성을 유발할 가능성이 높음. ○ 유전독성에서의 S9 fraction 과 사람의 cytochrome P450 효소 비교 : P450 의 동종효소 의 차이로 동물에서의 돌연변이원성을 사람에게 적용이 상당히 제한적이며 발암성의 적 용도 제한적임. 그러나 유전독성을 통해 시험물질이 사람에 있어서도 metabolic activation 가능성을 추정할 수 있음. ◎ 유전독성시험에서 S9 fraction 과 독성해석에서의 응용

4-4) Cytochrome P450 활성은 양날의 칼 ? 둘째 이유 : 활성자체가 reactive oxygen species 생성 ○ Cytochrome P450 에 의해 외인성물질이 생체전환되는 과정에서 uncoupling reaction 에 의해 정 상적인 대사경로의 이탈에 기인하여 유해활성산소 (reactive oxygen species, ROS) 가 발생하는 3 가지 Shunt pathway( 이탈경로 ) 가 발생한다. 이는 약물에 의한 간독성의 주요 원인이 된다. ○ 약물내성의 문제가 있지만 이러한 이유로 약물 복용을 삼가하는 주요 원인이다. ○

4-5) Biotransformation 의 Phase II ○ Phase II 반응은 Cytochrome P450 효소에 의해 생성된 대사체의 극성부위에 친수성 물질 첨가하는 반응 : 아미노산, 황, 당 등이 첨가 ○ 독성물질의 독성대사체를 친수성으로 전환하는 유일한 물질은 Glutathione ○ 간이 외인성물질에 대한 해독의 중추기관이 되는 것은 cysteine 을 합성하는 transsulfulation pathway( 황전이반응 ) 가 간에서만 존재하기 때문이다. ○ 화학물질에 의한 독성의 유무에 대한 개인차는 GSH 함량이 크게 좌우

◎ Glutathione 의 중요성과 합성 – 마늘 (Garlic) 과 엉겅퀴 (Silymarin)

4-6) Phase I 과 Phase II 를 통한 독성시험 결과의 해석 : 해석의 어려움 2 가지 예 ) OECD Test No. 425: Acute Oral Toxicity (Up-and-Down Procedure): For chemicals that are direct acting in their toxic mechanism, female rats may have a lower detoxification capacity than males, as measured by specific activity of phase I and II enzymes. However, all available information should be evaluated, for example on chemical analogues and the results of testing for other toxicological endpoints on the chemical itself, as this may indicate that males may be more sensitive than females. Knowledge that metabolic activation is required for a chemical’s toxicity can also indicate that males may be the more sensitive sex. 1) 암수의 독성 차이에 대한 이해 독성시험의 결과 해석 :

2) Dose-response relationship( 용량 - 반응관계 ) 의 역전 예 ) 동일한 용량군에서 특이한 반응의 개체 또는 저용량에서 고용량보다 높은 독성반응은 일차적으로 glutathione 의 함량에 기인하며 2 차적으로 cytochrome P450 활성 차이에 기인한다.

5. 유기독성물질의 bioactivation – 독성학의 출발 ○ 외인성물질의 생체전환을 통해 독성을 유발할 수 있는 독성대사체를 “reactive intermediates( 활성 중간대사체 )” 이라고 한다. ○ 주요 3 종류의 Reactive intermediates: 80% 이상이 Cytochrome P450 에 의해 생성 (electrophilic metabolite, - carbon-centered radical, - redox-active species)

5-1) 활성중간대사체 특성에 따른 독성시험 해석에서 응용 ○ 독성시험 전 독성물질의 독성 예측을 하는 QSAR(qualitative structure ‐ activity relationship: 활성 - 구조 상관 응용기술 )

5-2) 시험물질에 의한 독성 - 표적기관 (toxicity-target organ) ○ 친전사대사체 : Phase I 의 효소인 P450 에 go 생성된 친전성대사체 (electrophilic metabolites) 는 DNA 에 결합으로 돌연변이원으로 작용하며 때로는 단백질에 결합하여 세포괴사 (necrosis) 를 유도하기도 한다.

○ 탄소 또는 유기라디칼대사체 : Phase I 의 효소인 P450 에 의해 탄소부위에 라디칼이 형성되는데 이를 carbon-centered radical 또는 유기라디칼대사체이라고 한다. 유기라디칼대사체는 CYP450 에 생성되며 라디칼의 특성이 빠른 반응으로 발생 장소에서 독성유발 – 간의 표적기관이 가능성이 높음. 5-2) 시험물질에 의한 독성 - 표적기관 (toxicity-target organ)

○ Redox-reactive species: 간의 대사체가 장소 이동하여 표적기관독성 (traget organ toxicity): 골수 - 특이적 독성 - peroxidase 와 sulfatase 등의 두 효소가 혈액 및 골수에서 활성이 높다. 5-2) 시험물질에 의한 독성 - 표적기관 (toxicity-target organ)

6. Toxicodynamics( 독물독력학 )

6-1) Toxicodynamics 의 개념 ○ 독물독력학 (toxicodynamics): Reactive intermediates + 4 대 거대분자 ( 지질, 단백질, 당, DNA) ○ 독성의 가역성 (reversibility) 과 비가역성 (irreversibility): 독성시험 결과 판정에 중요한 기준 지 표가 됨

6-2) 비발암물질의 가역성 및 비가역성 변화에 대한 독성판정 기준 ○ 결과 판정에서 독성의 가역성 (reversibility) 의 중요성 : 시험물질에 의한 adverse effect 와 non-adverse effect 를 구분하는 핵심 지표 ○ 아래의 그림은 비록 시험물질에 의해 생물학적 및 통계학적 유의성이 있어도 가역성 등의 다양한 요소에 의해 adverse 및 non-adverse effect 를 재분류하는 흐름도

NOEL—-The highest exposure level at which there are no effects observed in the exposed population, when compared with its appropriate control NOAEL—The highest exposure level at which there are no statistically or biologically significant increases in the frequency or severity of adverse effects between the exposed population and its appropriate control. Some effects may be produced at this level, but they are not considered to be adverse or precursors to adverse effects LOAEL—The lowest exposure level at which there are statistically or biologically significant increases in the frequency or severity of adverse effects between the exposed population and its appropriate control: ◎ 독성시험의 지표와 Adverse effect – NOAEL, NOEL, LOAEL

◎ 반복투여독성시험에서의 독성판정의 기준

◎ 반복투여독성시험의 독성판정에 있어서 가역성을 반영한 예시 ◎ 독성판정 : -LOAEL: 2000mg/kg, NOAEL: 1000 mg/kg, NOEL: 수행된 농도로는 확인 불가능, -Target organ: 더 높은 농도에서 신장이 될 가능성이 있음

6-2) 발암물질의 비가역성 변화의 기전과 유전독성 시험결과 해석

○ Chemical carcinogenesis( 화학적 발암화 ) 의 Multi-stage theory ( 다단계이론 ): 세포의 발암은 정상세포가 다양한 종양전구 (pre-neoplastic) 또는 종양성 (neoplastic) 표현형 및 유전형을 발현하면서 여러 번의 돌연변이 과정의 다단계 즉 개시 - 촉진 - 악성전환 - 진행 에서 돌연변이 를 통해 암세포로 전환되는 매우 희귀한 과정이다. 6-2) 발암물질의 비가역성 변화의 기전과 유전독성 시험결과 해석

○ 발암의 multi-stage 와 암세포전환을 위한 돌연변이 유전자의 수 지금까지 발암을 위해 요구되는 돌연변이의 최소 유전자수는 대장암 (colon cancer) 이 의 4 개이다. 결장암과 관련하여 돌연변이의 주요 4 개 유전자는 APC(adenomatous polyposis coli), K-ras, DCC(deleted in colon cancer), 그리고 p53 등이다. ○ 암을 유발하는 유전자 돌연변이 존재 : 120 여 종류의 인체세포에 120 여종의 암종이 존 재. 사람의 전체 유전자 22,500 개 중 약 2% 유전자의 돌연변이가 발암과 관련이 있다. 이중 생식세포에서는 암과 관련된 유전자는 약 70 개, 체세포에서는 약 342 개의 유전자 가 관련이 있는 것을 추정되고 있다. ○ 암의 원인을 모른다는 것은 어떤 암에 어떠한 유전자의 돌연변이가 발생하며 그 수는 얼 마나 되는가에 대한 명확하게 설명할 수 없기 때문이다. 6-2) 발암물질의 비가역성 변화의 기전과 유전독성 시험결과 해석

○ 친전자성대사체가 Protein adduct, GSH 고갈 ( 가역성 ) 후 DNA adduct 형성 ( 비가역성 ) 6-2) 발암물질의 비가역성 변화의 기전과 유전독성 시험결과 해석

◎ 유전독성시험에서 비가역성 결과에 대한 독성해석 ● 단일작용기성 알킬화 - 유도물질은 gene mutation, 복수작용기성 알킬화 - 유도물질은 clastogenic mutation 을 유발한다. ● Gap, single strand break( 단일 ), double strand break( 복수 ), exchange, chromatid 및 chromosome 수준의 유전독성에 대한 시험물질의 특성 ● 복귀돌연변이와 염색체이상에서 결과 차이에 대한 해석 6-2) 발암물질의 비가역성 변화의 기전과 유전독성 시험결과 해석

6-3) 발암성시험을 통해 시험물질의 발암 특성을 다음과 같이 규정

7. 맺는 말 ○ 유기물질의 독성기전을 Central dogma 측면에서 이해 - 독성기전에 대한 이해는 toxicokinetics 측면에서 indirect or direct-acting agents, cytochrome P450 과 reactive intermediates( 특히 electrophilic metabolites), toxicodynamics 측면에서 4 대 거대분자와의 interaction, GSH depletion, chemical carcinogenesis 등의 과정을 함축한 독성기전의 central dogma 를 응용하여 독성시험의 결과에 대한 분석과 독성 판정에 도움을 줄 수 있다.