Tumor virology Laboratory 생화학 실험 (1) 9주차 흡 광 광 도 법 Tumor virology Laboratory 담당조교 : 신윤철(통합7학기), 신윤호(통합5학기)

Principle Light 일반적으로 빛(백색광) 이 물질에 닿으면 그 빛은 ①반사 ②흡수 ③통과하는 빛으로 나누어진다. 이 때 물질에 의해 흡수되는 빛의 양 (흡광도)은 물질에 농도에 따라 다름. 이와 같은 빛의 흡수현상을 일정한 파장에서 시료용액의 흡광도를 측정하면 그 파장에서 빛을 흡수하는 물질의 양을 정량할 수 있다. 이와 같이 시료용액의 흡광도를 측정하여 목적 성분을 정량하는 방법을 흡광광도법(absorption spectrophotometry)이라고 한다. 주로 자외선(180~320nm) 및 가시광선(320~800nm) 영역에서 빛의 흡수를 이용한다. TumorVirology Lab.

Cuvette의 직경이 빛의 투광율에 미치는 영향 투광도(T)와 흡광도(A) I0 흡광물질이 존재하지 않는 경우 I 흡광물질이 존재하는 경우 Cuvette의 직경이 빛의 투광율에 미치는 영향 투광도(transmittance), T는 시료를 통과한 입사광의 분율이다. 투광도의 범위는 0에서 1. 시료에 의해서 빛이 전혀 흡수되지 않으면, 투광도는 1. 모든 빛이 흡수되면, 투광도는 0 퍼센트 투광도, %T의 범위는 0%와 100% 사이. 투광도가 30%라면, 이것은 70%의 빛이 시료를 통과하지 못한다는 것 화학 분석에서 가장 유용한 양은 흡광도(absorbance)로서, 다음과 같이 정의한다. 즉, -log T = A I 투광도 : T = (T ≤ 1) I (흡광물질이 존재할 때의 빛의 강도), I0(흡광물질이 존재하지 않았을 때이 빛의 강도) I0 %T = T × 100 I0 I 흡광도 : A = log = -log = -log T I I0 I/I0 %T A 100 0 0.1 10 1 0.01 1 2 TumorVirology Lab.

Cuvette의 직경이 빛의 투광율에 미치는 영향 Beer-Lambert Law I0 흡광물질이 존재하지 않는 경우 I 흡광물질이 존재하는 경우 Cuvette의 직경이 빛의 투광율에 미치는 영향 빛의 투광도은 시료의 농도와 특별한 상관관계를 나타내지 않지만 그 로그함수는 다음과 같이 시료의 농도와 일정한 상관관계를 나타낸다. - log T=K×C C : 시료 중의 흡광물질의 농도, K: 상수 위의 식에서 -log T를 흡광도(absorbance,A)라고 하므로 흡광도는 시료의 농도와 특별한 상관관계를 지니게 된다. A = K×C 위의 A = KC의 관계를 Beer's law라고 한다. 하지만 시료의 흡광도는 위에서 설명한 시료중의 흡광 물질의 농도에 의해서만 결정되지 않는다. 즉, cuvette의 직경 또는 폭에 따라서 흡광도는 달라진다. 또한 흡광도는 물질 고유의 특성에 따라서도 달라지는데 이것을 몰 흡수계수(molar absorptivity)라고 하며 ε로 표시한다. TumorVirology Lab.

A = ε l C Beer-Lambert Law 그러므로 Beer's law는 다음과 같이 쓸 수 있다. A: absorbance(흡광도) = OD (optical density) ε: molar absorption coefficient (몰 흡광 계수) c: molar concentration (몰농도) l : light path length 흡광도 A는 무단위이다. 시료의 농도 c의 단위는 M이고, 통로길이의 단위는 cm. 몰 흡광계수 ε 의 단위는 M-1cm-1 . 특정 파장에서 얼마만큼의 빛을 흡수하였는가를 의미. TumorVirology Lab.

Standard curve를 이용한 시료중의 흡광물 흡광물질의 농도가 높을 때의 편차 Standard curve를 이용한 시료중의 흡광물 흡광도는 Beer’s law에 의해 흡광물질의 농도에 비례 그러므로 농도를 알고 있는 표준 시료의 용액에 대한 흡광도가 얻어지면 이를 기준으로 미지농도 시료에 대한 농도를 계산할 수 있게 된다. 그러나 시료 중 흡광물질의 농도가 매우 높게 되면 Beer’s law를 따르지 않게 된다. 시료용액의 흡광도는 대조구(blank test)의 흡광도에 대한 비율이기 때문에 단위가 없으며 시료 중의 흡광물질의 농도와 정의 상관관계를 지닌다. 그러므로 표준용액용액의 농도에 대한 흡광도가 얻어지면 미지농도 시료의 농도를 계산할 수 있게 된다. 그림 1은 시료 중의 흡광물질 농도를 측정하기 위하여 표준물질 1.0ppm, 2.0ppm, 3.0ppm, 4.0ppm 농도의 표준용액을 조제한 후 그 흡광도를 측정하여 작성한 standard curve이다. 만약 시료의 흡광도가 0.588을 나타내었다면 이 standard curve를 이용하여 시료 중의 흡광물질 농도가 2.7ppm이라는 것을 알 수 있다. 그림 2에 보는 바와 같이 흡광도를 측정하는데 있어서 시료 중의 흡광물질의 농도가 매우 높거나 낮으면 Beer's law를 따르지 않는다. TumorVirology Lab.

Spectrophotometer 특정 파장의 빛이 화학물질에 의해 흡수되는 정도를 측정하는 기기 큐벳(cuvette) 단색화 장치(파장 선택기)에서 나온 단색파장의 빛은 통로길이가 l 인 시료를 통과한다. 이 때 시료는 항상 큐벳(cuvette)이라고 하는 흡수용기에 넣는데 이것은 석영, 유리 혹은 플라스틱으로 만들어짐. 석영 (가시광선, 자외선 모두 투과), 유리와 플라스틱 (자외선을 흡수, 가시광선에서만 사용 가능) 흡광도를 측정할 때에는 대조액(blank)을 조제하여야 한다. Blank는 흡광물질이 없는 용액, 흡광물질을 제외하고는 시료용액과 반드시 동일하게 만들어져야 한다. TumorVirology Lab.

Spectrophotometer ► 올바른 조작 방법 TumorVirology Lab. 최대 흡광도를 나타내는 파장에서 측정해야 오차를 최소화할 수 있다. Cuvette을 두 개 이상 사용할 때에는 표준화된 cuvette을 사용하여야 한다. 먼지는 빛을 산란시킴으로써 시료의 흡광도가 증가하는 것처럼 보이므로, 먼지가 들어가는 것을 막기 위해 뚜껑을 덮어야 한다. Cuvette은 빛이 통과하는 면에 지문이 묻지 않도록 하기 위하여 꺠끗한 휴지로 다루어야 하며, 오염을 피하기 위해 매우 깨끗 이 하여야 한다. Cuvette holder에 cuvette을 잘못 놓거나, 편평한 모양의 cuvette을 180도 회전시킬 때에도 오차가 발생할 수 있다. TumorVirology Lab.

Procedure 준비물 Compound Y ( 410nm에서 최대흡광도의 물질) 실험과정 : 10, 20, 40, 60 uM Y compound in 100mM Tris-Cl buffer and Blank Spectrophotometer 실험과정 1) spectrophotometer의 wavelength를 410 nm로 맞춘 후, blank를 이용하여 absorbance로 맞춘다. 2) 농도가 주어진 4개의 compound Y 용액을 cuvette에 1mL 옮긴 후 spectrophotometer에서 O.D를 측정한다. 3) 측정한 O.D 결과를 이용하여 Standard curve를 그린다. 4) compound Y의 몰 흡광계수를 구한다. TumorVirology Lab.

Result 1. absorbance 2. Standard curve Y(uM) O.D410nm 10 20 40 60 10 20 40 60 Absorbance(O.D) Concentration(M) 3. 몰 흡광계수 TumorVirology Lab.

Further study 연습문제 1, 2번 %T가 99%와 0.1%인 시료 a, b 가 있다. a, b의 흡광도는 각각 얼마인가? TumorVirology Lab.

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