Column Basic Theory BENE TECHNOLOGY . 2008

베너 테크놀로지(Bene-Tech) KOREA Authorized YMC Distributor YMC 사: HPLC/MS /Prep Columns Packing Materials Solid Phase Extraction Big Scale Prep Sys BENE TECHNOLOGY . 2008

목 차 컬럼 위한 HPLC 기본이론 컬럼 사용 위한 Solvent Delivery System들 (Pump) 목 차 컬럼 위한 HPLC 기본이론 컬럼 사용 위한 Solvent Delivery System들 (Pump) 컬럼 사용시 Injector 컬럼에 연결되는 Detectors Column 컬럼 위한 분리능 & 이동상 BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼 위한 LC 기본이론 BENE TECHNOLOGY . 2008

Chromatography란? 혼합된 시료성분이 이동상과 고정상 사이를 흐르면서 흡착, 분배, 이온교환 또는 분자크기 배제작용 등에 의해 각각의 단일성분으로 분리되는 것을 말한다. 분리, 정성, 정량 등의 분석목적과 분리, 정제, 분취 목적에 이용 Injection Interaction Elution abacbc aabcbc a 크로마토그래피법은 혼합물을 단일물질로 분리하는 방법을 말한다. 여기서 고정상과 이동상의 두 가지 용어가 나오며 그들의 의미는 다음과 같다. - 고정상 : 컬럼 내 충진된 물질,즉 충진제를 말하며 충진제와 시료성분과의 흡착, 분배, 이온교환, 분자크기배제 등의 작용에 의해 혼합물이 단일물질로 분리가 일어나는 곳이다. - 이동상 : 시료성분을 주입구에서 검출기까지 이동시켜주는 역할을 하며, 분석시 시료 성분들간의 분리정도에도 영향을 준다. BENE TECHNOLOGY . 2008

Chromatography의 종류 Gas Chromatography Liquid Chromatography 이동상 : 기체 시료의 휘발성 분자량 < 500 열에 대한 안정성 고려 고정상과 시료의 화학적 친화력 및 b.p차에 의한 분리 Liquid Chromatography 이동상 : 액체 시료의 용해성 분자량 범위가 넓다. 상온근처에서 분석한다. Ionic compound분석도 가능 고정상 및 이동상과의 상호친화력에 의한 분리 BENE TECHNOLOGY . 2008

분자량에 따른 Chromatography의 비교 GC의 경우 시료의 휘발성을 고려해야 하므로 분자량 500미만까지 분석이 가능하다. LC의 경우 분리모드가 흡착 / 분배 / 이온 교환일 경우, 분자량 2000까지 분석이 가능하고 분자량이 큰 고분자인 경우 겔침투 크로마토그래피를 이용하여 10e7- 10e8정도의 분자량까지 분석이 가능하다. BENE TECHNOLOGY . 2008

HPLC System의 구성 Mobile Phase Reservoir Pressure Gauge Data System Pump Pulse Damper Injector Column Detector Fraction Collector HPLC System을 구성하는 기본성분은 다음과 같다. Pump : 용매저장용기에서 용매를 끌어서 시료주입기로 밀어주는 역할을 한다. Injector : 분석하고자 하는 시료를 주입하는 곳이며 또한 컬럼으로 보내기 위한 부분이다. Column : 다양한 재질의 용기내에 충진제가 채워져 있으며 시료 성분들을 각각의 단일성분으로 분리시켜 주는 곳이다. Detector : 컬럼에서 분리되어 나온 시료 성분의 양에 비례하게 전기적인 신호(signal)로 바꾸어 준다. Data System : 검출기에서 나온 신호값을 Y축에, 시간을 X축으로 하여 크로마토그램을 그려낸다. Fraction Collector : 분리된 성분을 순수하게 얻고자 할 때 이용된다. Gradient Device BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼 사용 위한 Solvent Delivery System들 (PUMP) BENE TECHNOLOGY . 2008

Solvent Delivery System (Pump) 용매 저장용기에서 용매를 끌어서 시료주입기로 밀어주는 역할 Pump의 요건 일정한 유속과 압력유지 가동이 쉽고 다양한 용매를 사용할 수 있어야 함 Pump의 특징 정확한 유속과 유량 조절 Pulse 방지를 위한 system 가동이 쉽고 여러 용매 사용 가능 Isocratic / Gradient까지 사용 내구성이 우수 BENE TECHNOLOGY . 2008

이동상 조성에 따른 분류 일정용매 조성법 (Isocratic Mode) 구배 용매 조성법 (Gradient Mode) : 분석시간동안 용매의 조성이 바뀌지 않는다. 구배 용매 조성법 (Gradient Mode) : 분석시간 동안 용매의 조성을 여러 가지 형태로 바꾸어 줄 수 있다. Single pump ; Low pressure Multiple pump ; High pressure BENE TECHNOLOGY . 2008

일정용매 조성법 ---- 가장 간단한 형태의 구성 한 Pump가 일정조성의 용매를 밀어줌 실험 중 용매의 조성이 바뀌지 않음 column pump detector injector solvent reservoir 가장 간단한 형태의 구성 한 Pump가 일정조성의 용매를 밀어줌 실험 중 용매의 조성이 바뀌지 않음 분석시간동안 용매의 조성이 일정한 것을 말한다. 즉 이동상이 60% ACN / 40% H20 인 경우 분석시간동안 이 조성을 유지하면서 분석이 진행되는 것이다. 복잡한 화합물인 경우 여러 가지 컬럼을 교체하여 분석하여도 분석이 안 될 경우에는 분석시간동안 용매의 조성을 바꿀 수 있는 다른 모드, 즉 Gradient Mode를 사용해야 한다. BENE TECHNOLOGY . 2008

구배용매 조성법 (I) 분석동안 용매의 조성을 바꾸어 줄 수 있음 시간에 따른 변화 및 그 형태까지도 변화시킬 수 있다. Single pump - Low Pressure - Helium sparging ,Degassing 반드시 해야 한다. solvent A solvent B pump mixer 복잡한 화합물을 분리할 경우 사용하는 용매의 강도를 변화시킴으로써 분리도를 개선하고 분석시간을 단축할 수 있는데 이러한 방법을 Gradient Mode라 한다. Gradient Mode는 두 가지로 나뉘어 질 수 있다. Low Pressure Gradient Formers : 용매의 조성을 변화하기 위해 2개 내지 그 이상의 용매들을 섞는 mixer가 펌프 앞부분에 있으며 이때 용매는 low pressure상태에서 섞이게 된다. : 이러한 형태는 1개의 High Pressure Pump를 사용하여 Gradient가 가능하며 값이 저렴하고 사용이 간편한 장점이 있지만 단점으로는 용매를 완전히 degassing시킨 뒤 사용해야 한다. 만약 bubble이 pump로 들어갈 경우 유량의 정밀도에 영향을 줄 수 있고 펌프도 치명적인 손상을 받을 수 있다. BENE TECHNOLOGY . 2008

2) Multiple pump – High Pressure 구배용매 조성법 (II) 2) Multiple pump – High Pressure Pump A Pump B solvent A solvent B Mixer High Pressure Gradient Formers : 분석하는 동안 사용되는 용매가 각각의 다른 High Pressure Pump에 연결되어 있으며 컬럼 앞부분에 연결된 mixer에서, 즉 high pressure상태에서 용매는 섞이게 된다. : 장점 - 각각 펌프의 outlet을 독립적으로 programming하여 컬럼으로 이동상이 들어가기 전 mixer에서 용매들을 섞어주므로 모든 형태의 gradient mode가 가능하다. : 단점 - 별도의 gradient controller가 필요하므로 가격이 비싸다. BENE TECHNOLOGY . 2008

Pump 작동시 주의사항 사용 용매의 탈기 용매가 없는 상태에서 Pump on 하지 말 것 Buffer 사용 후 물로 충분히 세척 다른 용매를 사용하는 경우 섞임성 확인 Pump priming 실시 Pulse 없는 상태로 계속적인 용매 흐름 조절 Pump 압력 확인 (높은지, 낮은지, 일정한지 확인) 용매 내에 용해되어 있는 가스성분(주로 산소)은 이동상 및 고정상과 반응을 일으킬 수도 있고 펌프에 무리가 갈수도 있기 때문에 사용 전에 탈기 과정을 실시하여야 한다. Buffer사용 후 세척하지 않으면 펌프에서 염이 석출되어 Pump head의 outlet부분이 막히게 되거나 수명을 단축시킨다. 세척 시 가장 좋은 방법은 낮은 유속으로 장시간 씻어주는 것이며, 일반적으로 세척양은 컬럼 dead volume의 20배 정도가 적당하다. 용매를 바꿀 경우 용매들간 섞이는 정도를 고려하여야 한다. BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼사용시 Injector BENE TECHNOLOGY . 2008

Injector 이동상에 시료를 Loading 하여 Column으로 보내는 역할 Injector 의 종류 Rheodyne Injector (Valve Injector) Automatic Injector 시료주입기가 갖추어야 할 요건은 다음과 같다. 사용하기가 편리해야 한다. 시료가 컬럼에 좁은 띠 형태 (일반적으로 컬럼 dead volume 의 1/100이하)로 주입되어야 피크의 broadening현상을 최소화할 수 있다. 결과의 재현성이 있어야 한다. High back pressure상태에서도 작동이 가능해야 한다. BENE TECHNOLOGY . 2008

Injector 작동시 유의사항 잘 세척된 Syringe 사용 시료 주입시 기포는 완전히 제거 강한 세척 요구 시, 사용용매  Acetone  Dichloromethane 순으로 세척 Auto injector needle wash 용 용매 사용 시 주의 시료확산을 방지하기 위해 injector와 column, column과 detector사이 연결을 짧게 연결(0.009inch) 잘못된 Tubing 연결 시 dead volume 생김. - 주사기에 기포가 있을 경우 실험결과의 재현성을 얻기 힘들므로 기포는 완전히 제거하여야 한다. - Needle wash용 용매는 시료와 이동상의 화학적인 성질을 고려하여 선택하여야 하며 일반적인 선택방법은 다음과 같다. ----------------------------------------------------------------------------------- 이동상 Needle Wash Buffer aqueous, Reverse phase 50% H2O 50% MeOH Non aqueous, Reverse phase 100% MeOH Normal phase Mobile phase GPC Mobile phase Ion exchange H2O BENE TECHNOLOGY . 2008

Rheodyne Injector 주입량이 loop에 의해 정해짐 Loop 를 교체하여 주입량 변화시킴 Sample loop 세척이 요구 Rheodyne injector는 sampling valve형태 주입구를 갖는다. 장점 : 신속하고 재현성 있는 결과를 얻을 수 있으며 주입시 분석자의 주입기술에 따라 발생하는 주입량의 오차를 최소화할 수 있다. 단점 : 시료 주입량이 변할 때마다 그 양에 맞는 loop를 선택하여 설치하여야 한다. Rheodyne injector 사용 시 syringe는 항상 Rheodyne 전용을 사용해야 하며 규격은 외경 0.028 inch, 길이 2inch이고 바늘 끝이 직각으로 뭉툭하다. 밸브의 재질은 스테인레스 스틸과 PEEK재질 2가지가 공급되며 분석에 알맞는 것을 선택하여 사용한다. BENE TECHNOLOGY . 2008

Auto Injector Free injection하여 생산성을 향상 조건입력 가능 무인 가동할 수 있으므로 분석 시간 단축 온도 조절을 통해 시료의 변성 가능성을 최소화 시료의 주입량의 오차가 거의 없으므로 재현성 우수 Auto priming 및 Auto needle washing이 가능함 Heater나 Cooler를 장착하여 시료가 들어있는 Vial 부분을 4~40C 범위로 조절이 가능하다. Needle wash pump의 auto-priming이 가능 Auto-needle washing 기능은 시료의 연속 주입시 발생할 수 있는 주사기의 오염을 방지한다. Auto Standards 기능 : 먼저 standards를 주입 >> 시료들을 주입 >> 다시 같은 standards를 주입 Auto Addition 기능 : common vial과 sample vial에 들어 있는 용액의 일정량을 각각 취하여 혼합한 뒤, 그 총량을 컬럼에 주입하는 기능이다. 이 기능은 유도체시약이나 표준물 등의 자동적인 첨가등에 유용하게 사용될 수 있다. BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼과 연결되는 Detector 들 BENE TECHNOLOGY . 2008

Detector의 종류 Optical Detector Electrochemical Detector UV/Visible Detector --- a. Fluorescence Detector --- b. Refractive Index Detector --- c. Electrochemical Detector Conductivity Detector --- d. Electrochemical Detector --- e. 검출기는 그들의 작동원리에 따라 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 광학적 원리를 이용한 검출기 전기화학적 원리를 이용한 검출기 이들 검출기들은 분석하고자 하는 시료의 특성에 따라 알맞게 선택하여야 한다. BENE TECHNOLOGY . 2008

여러 가지 Detector의 특징 RI UV/Vis Fluorescence Electro- chemical Conductivity Response Universal Selective Sensitivity (typical) Microgram Nanogram Picogram Flow sensitivity YES NO Temperature sensitivity 위 표는 여러 가지 검출기들의 특성을 나열한 것이다. BENE TECHNOLOGY . 2008

A = Ebc (Lambert-Beer Law) A. UV/Vis Detector 광원에서 특정 파장의 빛이 광이나 장치를 거쳐 cell내의 시료에 투사되면 일부는 흡수되고, 일부는 시료를 통과하게 되는데, 특정한 시료는 특정파장의 빛에 대한 흡광도가 높아서 시료를 투과하는 빛의 강도는 상대적으로 작아지게 된다. 이 때 흡수되는 빛의 양(A)은, 용액내의 흡광 시료의 농도 (C)에 비례하고 빛의 파장과, 시료의 특징적인 흡광 spectrum(Molar Absorptivity), 빛이 시료를 통과하는 거리 (path length, b) 와 관계가 있다. A = Ebc (Lambert-Beer Law) 가장 일반적으로 사용되는 검출기 UV-VIS광의 흡수에 기본을 두고 있으며, 각 성분은 그들이 갖는 작용기의 종류나 주변환경에 따라 특정파장에서 광선을 흡수한다. 흡수정도는 시료농도의 양에 비례하게 된다. UV-VIS광을 흡수하는 물질들은 π-bonding electrons나 비공유 전자들을 가져야 한다. 예) olefins, aromatics, >C = O, >C=S, -N=N-등을 갖는 화합물 안정화되는 시간이 짧아 사용하기 간편하다. BENE TECHNOLOGY . 2008

A. UV/Vis Detector (cont.) UV Cutoff of Common Solvent Solvent UV Cutoff Water 180 n-Heptane 197 Methanol 210 Cyclohexane 200 n-Propanol 205 Carbon tetrachloride 265 Acetonitrile 190 Chloroform 245 THF 230 Benzene 280 Acetone 330 Toluene 285 Methyl acetate 260 Methylene chloride 232 Ethyl Acetate Tetrachloroethylene Nitromethane 380 1,2-Dichloroethane 225 분석 시 이동상의 UV Cutoff값보다 높은 값의 파장에서 실험을 하여야 이동상에 의한 흡광의 영향을 최소화할 수 있다. BENE TECHNOLOGY . 2008

B. Fluorescence Detector 원리 Excitation filter를 통과한 빛은 sample cell에 존재하고 있는 시료 분자를 excited state로 만들어 준다. 이 시료분자가 Ground state로 떨어지면서 흡수한 파장보다 긴 파장의 빛을 방출하게 된다. 시료는 분자구조가 형광성을 띠거나 형광 유도체를 만들었을 때 이용 발광하는 빛의 양은 시료의 농도에 비례하며 발광량에 따른 전기적 신호의 크기가 정량의 척도가 된다. 형광 물질 Benzene 고리 치환물 중 작용기가 -OH, -OCH3, -H2, -NH(CH3), -N(CH3)2, -F, -CO등인 화합물 Poly-aromatic hydro-carbons, Carbamate pesticides , Alfatoxins, Vitamins and Amino acids Chemically derivatized compounds which are not normally fluorescing 형광 검출기 : 형광성을 갖는 시료에 대해 매우 선택적으로 또한 높은 감도로 분석 응용범위 : 유도체화된 아미노산, carbamate, PAH, Vitamine E, Riboflabin UV-VIS검출기에 비해 100배 정도 뛰어난 감도 특히 압력과 온도의 변화에 대해 비교적 안정 BENE TECHNOLOGY . 2008

C. RI Detector 원리 응용 범위 시료의 농도 변화에 따른 굴절률을 측정한다. Reference cell은 이동상으로 채워지고, 분석시간동안 이동상은 sample cell만을 통과하면서 흐른다. 응용 범위 굴절률에 의하여 분석하므로 거의 모든 물질에 사용 할 수 있으나 주로 고분자, 당 등의 분석에 이용된다. 일반적으로 UV/ Visible, Conductivity검출이 어려운 시료에 이용 한다. 이동상과 시료/이동상과의 굴절율의 차이를 측정 Exclusion chromatography에서 많이 사용 UV-VIS검출기에 비해 100배 정도 감도가 떨어짐 굴절율검출기는 이동상의 조성변화 및 온도 그리고 유속에 매우 민감하므로 분석시 온도/유속을 일정하게 유지해야 하며 또한 분석시 이동상조성이 변하는 GRADIENT MODE는 사용이 불가하다. BENE TECHNOLOGY . 2008

D. Electrochemical Detector 원리 검출기의 Working electrode와 시료 사이의 전기화학 반응 : 산화/환원 반응으로 인한 current의 차를 측정 작은 DC전압이 working electrode에 걸리면서 working electrode에 접촉된 시료성분이 산화 환원을 일으킨다. 산화 환원으로부터 발생된 electrolytical current가 측정되고, 이것은 analog signal로 출력하게 된다. 비교적 낮은 전위에서 수용액 내에서 산화반응이 쉽게 일어나는 이온의 검출에 사용된다. 환원반응은 대체로 적당하지 않은데, 이는 용존 산소를 제거해야 하는 번거로움이 있기 때문이다. 이용범위 Catecholamine, 뇌조직 내 신경전달물질의 산화, phenolic compound와 쉽게 산화되는 무기 착화합물 등 전기화학검출기는 다른 검출기에 비해 높은 선택성과 감도를 제공한다. 이는 주어진 전극/전압의 조합에 의해 단지 좁은 범위의 화합물만이 산화/환원반응을 하기 때문이다. BENE TECHNOLOGY . 2008

D. Electrochemical Detector Working electrode Silver (Ag) Iodide, Sulfide, Cyanide Glassy Carbon Phenolic compound catecholamine Gold (Au) Carbohydrate Platinum(Pt) Hydrazine, OCl-,Alcohols 전기화학 검출기의 working electrode는 분석하고자하는 물질에 따라 선택하여 사용할 수 있다. 현재 사용되고 있는 working electorde에는 silver, glassy carbon, gold, platinum이 있다. BENE TECHNOLOGY . 2008

E. Conductivity Detector 원 리 금속 도체는 다음과 같이 ohm법칙에 따른다. 검출실내의 이온 농도가 증가하면 K값이 커지고 R값이 작아져서 두 L/A가 일정할 때 두 전극간의 전기 전도도가 커지게 된다 R = 두 전극간의 전기적 저항 A = 전극의 면적 L/A = 검출실 고유상수 K = 용액의 전도도 L = 전극사이의 거리 1 R = KA 이온농도증가에 따른 전기전도도 값을 측정 양이온 및 음이온 등의 모든 이온시료분석에 사용 전도도 값은 온도에 매우 민감하므로 시료 분석시 온도를 일정하게 유지하여야 안정한 baseline을 얻을 수 있다. BENE TECHNOLOGY . 2008

- Column - BENE TECHNOLOGY . 2008

Column 재질 : Silica, Alumina, Silica-Bonded, Polymer(resin)-Bonded 여러 가지 물질을 각각의 성분으로 분리시키는 곳 재질 : Silica, Alumina, Silica-Bonded, Polymer(resin)-Bonded 입자의 크기 3um, 5um, 10um, 15um, 20um, 75um 입자의 형태 Spherical, Irregular Pore 크기 : 80 A ~ 300 A BENE TECHNOLOGY . 2008

충진재의 특성 Pore size & Distribution Small Pore = higher efficiency = less band broadening Spherical or Irregular Irregular = higher Surface area = higher carbon load Spherical = lower pressures = better structural stability = longer life Particle size Smaller particle = higher operating pressure = higher efficiency 컬럼의 효율은 작은 Pore size와 Particle size, Irregular type일 경우에 좋아진다. 컬럼의 수명면에서 본다면 Irregular type보다는 Spherical type이 좋다. BENE TECHNOLOGY . 2008

분리기작에 따른 분류 Normal phase --- a. Reverse phase --- b. Ion exchange --- c. Size exclusion --- d. BENE TECHNOLOGY . 2008

a. Normal Phase Functional group의 polarity에 의한 분리 흡착작용 일반적으로 non-aqueous, non-polar solvent 사용 극성이 큰 물질이 가장 나중에 용출 Si-OH Si-OH---OH O Hexane polar Polarity가 큰 물질 일수록 용출되는 속도가 느려진다. 용출속도 : naphthalene < phenol 일반적으로 Normal phase column을 사용한 경우 polar한 물질분석 시 tailing현상이 크다. BENE TECHNOLOGY . 2008

a. Normal Phase (cont.) 순상충전컬럼의 종류 Silica Phase Bonded Phase YMC Pack Sil, YMC Pack Sil-6 Bonded Phase YMC-Pack CN, NH2 YMC-Pack PA BENE TECHNOLOGY . 2008

b. Reverse Phase Bonded compound(C18, C8, CN, ph)와 분석물질간의 상호작용에 의한 분리 분배작용 비극성이 큰 물질이 가장 나중에 용출 -Si-O-Si-C18 -- OH CH3CN/H2O non-polar 현재 가장 많이 이용되는 컬럼의 형태이다. 주된 분리기작이 Van der Waals힘이므로 많은 수의 복잡한 물질을 분리할 때 효과적이다. BENE TECHNOLOGY . 2008

b. Reverse Phase 컬럼 종류 YMC Ultra HT Pro C18 YMC Ultra HT Hydrosphjere C18 YMC-Pack Pro C18 Hydrosphere C18 YMC-Pack Pro C18 RS YMC-Pack ODS-A,AM,AQ YMC-J’sphere ODS-H80,M80,L80 YMC-Pack Polymer C18 BENE TECHNOLOGY . 2008

b. Reverse Phase (cont.) C18 Column 제조방법 Silica (SiO2) Acid Treatment Free Silanol (Si-OH) Chemical Bonding of C18 End-capping by TMS Element Analysis BENE TECHNOLOGY . 2008

b. Reverse Phase (cont.) End-capping이란? TMS-Cl -Si-OH non-polar -Si-O-Si-C18 TMS-Cl -Si-O-Si-(CH3)3 End-capping의 효과 : End-capping을 하면 -NH2와 같은 염기성 시료의 분석시 문제가 되는 peak의 tailing현상을 줄일 수 있다. 왜냐하면, SiOH의 분자구조를 가지고 있으면 산으로 작용하여 SiO-형태의 음이온구조를 형성하게 된다. 이 음이온은 중성의 Mobile phase를 사용하여 분석을 할 때 염기성시료와의 상호작용으로 말미암아 Peak Broading이나 Tailing의 효과를 형성하게 된다. 이러한 작용은 염기성시료를 분석할 때 많은 제약을 가져오게 되어 현재는 많은 컬럼에서 End-capping을 하고 있다. BENE TECHNOLOGY . 2008

c. Ion Exchange - 이온화도의 차이에 의해 분리 이온교환작용 + counter ion sample BENE TECHNOLOGY . 2008

c. Ion Exchange (cont.) 컬럼 충진재의 종류 Cation Column Anion Column SO3- NR3+ COO- NH3+ BENE TECHNOLOGY . 2008

c. Ion Exchange (cont.) 이온교환 컬럼의 종류 Anion/Cation SAX(Strong Anion Exchanger)/SCX YMC Bio pro series columns BENE TECHNOLOGY . 2008

d. Size Exclusion 원리 충진제 응용 물리적인 분리방법, 이동 경로차에 의한 분리 큰 분자가 가장 먼저, 작은 분자가 가장 나중에 용출 충진제 종류 : Styrene divinylbenzene 일정크기의 pore를 가진 충진물을 사용 응용 고분자의 분자량 및 분포도를 구함. Plastic processing 및 물성예측에 매우 중요한 정보로 사용 BENE TECHNOLOGY . 2008

d. Size Exclusion 분자체 컬럼의 종류 GPC : Poly Styragel Series Aqueous GPC : YMC Diol 60.120.200.300. Aqueous GFC : YMC Diol 60.120.200.300. BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼의 선택 화학적인 요소 (선택인자 (a), 용량인자 (k)) 충전제의 표면성질 이동상의 조성 기계적 요소 (이론단수(N)) 충전용기의 내경, 길이, 재질 충전제의 입자 크기 충전제의 분포상태 BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼 효율 계산(이론단수) - 5sigma법이나 tangent법이 많이 사용된다. BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼의 보관 (I) 충진제와 반응하지 않는 용매로 채워서 보관. Normal phase column -- Hexane으로 채움 충진제와 반응하지 않는 용매로 채워서 보관. Normal phase column -- Hexane으로 채움 Reverse phase column 세척 후 60%~ 70% 유기 용매(CH3OH, MeOH)로 채움 장기 보관시 100% CH3OH, CH3CN로 채움 - Column 보관용매 - 10% IPA in water ; Delta-pak C4, C18(100,300A) Hexane ; uBondapak CN, NH2(NP), Resolve Si > 20% organic in water ; uBondapak C18, CN, NH2(RP), phenyl Novapak C8, CN(RP), phenyl Resolve C8, C18, CN(RP) Bondapak C18 95% Hexane/5% Ethyl acetate ; uPorasil, Porasil, Novapak Si 0.07M (NH4)2SO4를 첨가한 유기용매 : Novapak CN(NP) Resolve CN(NP) BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼의 보관 (II) Ion exchange column 무기 양,음이온 장기간 보관 : 10% CH3CN 단기간 보관 : 이동상 or 5% CH3CN IC-pak Cation column : 2mM HNO3로 보관 유기 Cation column 장기간 보관 : 10%에탄올 단기간 보관 : 물로 채워 4도에서 보관 유기 Anion column : 물로 채워 4도에서 보관 BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼의 보관 (III) Size exclusion column 지용성 GPC 컬럼 : Shipping solvent로 보관 수용성 GPC 컬럼 : 0.05% Sodium Azide/물 or 20% 이하의 유기용매로 보관 수용성 GFC 컬럼 : 0.05% Sodium Azide/물 or 20% 이하의 유기 용매로 보관  Sodium Azide는 미생물의 오염 방지 BENE TECHNOLOGY . 2008

컬럼의 세척 및 재생법 Normal phase column (컬럼 부피의 10배) MeOH-Metylene Chloride-Heptane(Isooctane) Reverse phase column (컬럼 부피의 10배) H2O-MeOH-H2O Ion Exchange column 무기,유기 음이온 컬럼 : 물-0.1M NaOH-물-30% 아세트산 (or 0.1N HNO3)–물 무기,유기 양이온 컬럼 : 물-0.1M NaOH(1~2ml)-물- 30% 아세트산 (1~2ml) Size exclusion column 이동상으로 흘려 세척함 BENE TECHNOLOGY . 2008

- 분리능 & 이동상 - BENE TECHNOLOGY . 2008

R=1/4(1-1/a )SQRT(N){k`/(1+k`)} 분리능(Resolution) R=1/4(1-1/a )SQRT(N){k`/(1+k`)} a : 선택성 인자 N : 이론단수 (컬럼의 효율) k` : 용량인자 BENE TECHNOLOGY . 2008

이동상 – 용매의 선택 및 준비 용매조건 물의 경우 18 mega ohm이상 Low Viscosity 용매간 섞임성 (miscibility No. 차가 15미만 ) 이동상은 고정상을 변화시키면 안됨 분리하고자 하는 시료는 이동상에 녹아야 한다 UV cutoff, Refractive index가 낮은 용매 ---------------------------------------------------------------------------------------------- Polarity Solvent Viscosity CP, 20C Miscibility 0.0 N-Hexane 0.92 29 1.8 Triethylamine 0.38 26 2.3 Toluene 0.59 23 3.0 Benzene 0.65 21 3.4 Methylene chloride 0.44 20 4.2 Tetrahydrofuran 0.55 17 4.3 2-Propanol 2.35 15 5.4 Acetone 0.32 15,17 6.2 Acetonitrile 9.36 11,17 6.5 Dimethylsulfoxide 2.24 9 6.6 Methanol 0.60 12 9.0 Water 1.00 - --------------------------------------------------------------------------------------------- BENE TECHNOLOGY . 2008

Buffer 용액 사용 목적 이온성 시료일 때 - 이온억제 및 이온쌍 형성 생리 활성물질의 순수 분리, 정제시 (pH조절) 이온성 물질 분리시 이온강도 조절 BENE TECHNOLOGY . 2008

이동상 변형체 목적 : 역상 방법에서 이온성 시료의 분리능을 높일뿐만 아니라 시료를 비이온화시키기 위하여 사용 종류 PIC A / Low UV PIC B Series Ion exchange : 시료를 이온의 형태로 분리를 시도한다. 분리모드 - Ion exchange 보통 이온컬럼을 사용한다. Ion suppression : 시료를 이온의 형태가 아닌 중성의 분자로 분리한다. 분리모드 - Reverse phase 보통 역상컬럼을 사용한다. Ion pairing : 시료를 착물의 형태로 분리한다. 분리모드 – Reverse phase PIC A 시약의 종류 Tetraethyl ammonium phosphate Tetrabutyl ammonium phosphate Tetraoctyl ammonium phosphate Tetradecyl ammonium phosphate PIC B 시약의 종류 Pentane Sulfonic acid Hexane Sulfonic acid Haptane Sulfonic acid Octane Sulfonic acid BENE TECHNOLOGY . 2008

이동상 제조 용매 준비 Filter 탈기 초순수 (비저항값 ;18mega ohm) 부피 대 부피 계량 계량시 volume 비로 계량 후 혼합 용매 성질에 따라 흡열 , 발열 반응 가능 >>부피비가 달라질 수 있다 Filter 수용성 FILTER(PVDF) >> WATER로 ACTIVATION 지용성 FILTER(PTFE) >> MeOH or 적합한 용매로 탈기 이동상에 용존된 air, oxygen, bubble제거 Vacuum Degassing (진공탈기) >> 여과 + 탈기 Helium Sparging >> 직접 이동상에 sparging Ultrasonication (초음파 파쇄) BENE TECHNOLOGY . 2008