Regulation of neuroinflammation by shogaol from Zingiber officinale Roscoe 가천대학교 약학대학

Neuroprotection Ischemia Alzheimer Parkinson disease Disease Mitochondria dysfunction Oxidatative stress Inflammation Ca2+  Neuroprotection Neuronal cell death

Relationship between inflammation and tissue injury Relationship between inflammation and tissue injury. Tissue damage can be triggered by a number of genetic or environmental factors. While reversible tissue damages could be repaired for a functional recovery, irreversible damages associated with inappropriately controlled inflammation (chronic inflammation) could lead to diseases.

Microglia and Neuroinflammation Neuroinflammation underlying basis of neurodegenerative diseases Neuroinflammation is the process by which microglia and astrocytes Neuroinflammatory diseases result from an abnormally high or chronic activation of microglia and astrocytes. 마이크로 글리아와 뉴로인플라메이션과의 관계에 대해 살펴보겠습니다. Neuroinflammation은 알츠하이머, 파킨슨 디지즈, 뇌혈관 질환 같은 퇴행성 질환들의 시작과 진행에 필연적으로 따라오는 과정입니다. 그리고 neuinflammation은 뇌에서 글리알 셀인 microglia와 astrocyte에 의해 진행이 되게 됩니다. neuronflammation 과정은 astrocyte 보다는 마이크로글리아에 의해 더 크게 영향을 받습니다. 결과적으로 보면 다양한 퇴행성 뇌질환의 시작에 있어 inflammation이라는 과정이 필연적으로 수반되며 그것은 microglia나 astrocyte가 비정상적으로 high chronic한 activation

Microglia cells  Immune cells  5-10% in the cell population of brain  Host defence and tissue repair 마이크로 글리아는 뇌에서 존재하는 면역관련세포로서 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트와 더불어 뉴런을 보호하고 지지해주는 역할을 해주는 글리알 세포 중의 하나입니다. 뇌에 존재하는 macrophage와 같은 역할을 수행하고 있는 세포라고 보시면 됩니다. 뇌에서 차지하는 비중은 작은편으로 5-10%정도를 차지하고 있습니다. Host difence와 tissue repair 기능을 가지고 있습니다. 형태는 오른쪽의 사진과 같습니다.

Histological and functional consequences of microglial activation Transition from ramified to amoeboid appearance Increased chemotaxis towards damaged parts of the CNS Secretion of soluble mediators of inflammation and toxicity TNF-α, Il-1β, Nitric oxide, ROS Resting microglia in normal brain Activated microglia in brain disease 마이크로글리아 활성화의 조직학적 기능적인 결과들에 대해 알아보겠습니다. 아래쪽 그림을 보시면 왼쪽은 resting state라고 말하는 정상뇌에서 마이크로글리아의 사진이고 ramified한 형태를 보여주고 있습니다. 오른쪽 사진은 활성화된 마이크로글리아의 amoeboid한 형태를 보여주고 있습니다. 그리고 CNS에서 데미지입은 부분으로의 증가된 주화성을 보입니다. 활성화된 마이크로 글리아는 외형만 바뀌는 것이 아니라 TNF-alpha, interleukin 1-beta, nitric oxide, ROS 다양한 inflammatory factors 들을 방출하게 됩니다. 결과적으로 이렇게 방출된 factors 들은 신경세포 사멸을 유도하게 됩니다. 그래서 일반적으로 마이크로글리아는 뇌에서 tight하게 regulation되고 있으며 뇌질환같은 원인들에 의해 과활성화 된 경우는 오히려 신경세포에 좋지 않은 영향을 미칩니다.

Mechanism for neuronal degeneration by microglial activation 이것은 마이크로글리아의 활성화에 따는 신경퇴행의 mechanism을 보여주는 그림입니다. A는 normal 상태를 보여주고 있습니다. a는 뉴런이고 b는 astrocyte c는 microglia d는 내피세포입니다. B는 가역적인 마이크로글리아 활성화 상태입니다. E 유출된 serum factor들이 마이크로글리아 활성화를 촉진합니다. 마이크로글리아는 ramified한 형태에서 amoeboid한 형태로 변화합니다. 활성화된 마이크로글리아는 TNF-알파, NO, oxygen radical 같은 뉴런에 damage를 주는 물질들을 생산합니다. 또, IL-1베타와 IL-6같은 다양한 cytokine을 생산하여 astrocyte의 기능에 영향을 줍니다. TNF-알파같은 cytokine은 내피세포에 영향을 미쳐 BBB의 손상을 일으킵니다. Astrocyte는 NGF같은 neuroprotective factor를 생산합니다. C는 비가역적인 마이크로글리아의 과활성화 상태를 보여줍니다. BBB가 손상되므로써 blood cell들이 침투하게됩니다. 활성화된 마이크로글리아와 침투한 매크로파지들은 뉴런에 damage를 주게 됩니다. D는 neural degeneration후에 회복상태를 보여줍니다. 여기서 astrocyte는 증식하여 뉴런이 있던자리를 채우게 됩니다. 마이크로글리아의 활성화는 중단되고 mophology도 normal한 상태와 같이 변합니다.

Signal pathway in microglial activation by LPS CD14 LPS p50 p50 IkB P IkB LPS p65 p65 P TLR4 MD-2 IKKγ P IKK1 IKK2 P Toxic to neurons p50 P IkB p65 MAPKs NO TNF-α prostaglandins iNOS TNF-α p65 p50 AP1 COX-2

Medicinal herbs as a neuroprotector that targets neuroglial inflammation Medicinal herbs as a neuroprotector that targets neuroglial inflammation. Resting neuroglia can be activated by inflammatory stimuli such as LPS, IFNγ, and TNFα. Activated neuroglia secrete a variety of inflammatory mediators including ROS, nitric oxide, TNFα, and IL-1β, which cause neuronal injury (thereby resulting in neurodegeneration). Herbal medicine may be neuroprotective by blocking the inflammatory activation of neuroglia.

Zingiber officinale Roscoe (Ginger) Anti-inflammatory activities Anti-oxidant actions Anti-microbial actions Anticarcinogenic properties Ginger has been used throughout the world as spice, food and traditional herb. most abundant is [6]-gingerol. The pungency of dry ginger mainly results from shogaols {for example, [6]-shogaol (2)}, which are dehydrated forms of gingerols. B.H. Ali et al. Food and Chemical Toxicology 46 (2008) 409–420

Effect of Zingiberis Rhizoma on LPS-induced NO production in BV-2 cells * * Nitrite (μM) LPS (100 ng/ml) – + + + + 1 5 10 Zingiberis Rhizoma (g/ml)

Effect of Zingiberis Rhizoma on cell viability in BV-2 cells LPS (100 ng/ml) – + + + + 1 5 10 Zingiberis Rhizoma (g/ml)

Major constituents of ginger ([6]-gingerol and [6]-shogaol) Degradation rates of [6]-gingerol to [6]-shogaol were also found to be pH dependent. [6] – paradol, [6] - gingerdione Shogaol

Effect of gingerol and shogaol on LPS-induced NO production in primary microglia cells * Nitrite (M) ** LPS (100 ng/ml) – + + + + + + + 1 5 10 1 5 10 6-gingerol (M) 6-shogaol (M)

Effect of shogaol, wogonin, and NMMA on LPS-induced NO production in BV-2 cells * ** Nitrite (M) *** ** *** LPS (100 ng/ml) – + + + + + + + + + + 1 5 10 1 5 10 1 5 10 shogaol (M) wogonin(M) NMMA(M)

Effect of shogaol on the protein expressions of iNOS in microglia cells BV-2 cells 6-shogaol iNOS Tubulin Control - 1 µM 5 µM 10µM 10µM + LPS (100ng/ml) Primary microglia cells iNOS -tubulin 6-shogaol - - 10µM + LPS (100ng/ml)

Effect of shogaol on the protein expressions of COX-2 in BV-2 cells Tubulin Control - 1 µM 5 µM 10µM 10µM + LPS (100ng/ml) Primary microglia cells COX-2 -tubulin 6-shogaol - - 10µM + LPS (100ng/ml)

Effect of 6-shogaol on PGE2 production in LPS-induced primary microglia cells. * ** LPS (100 ng/ml) 6-shogaol (M) – + 1 5 10 PGE2 (pg/ml) 기존의 연구에 의하면 LPS에 의해 활성화 된 마이크로글리아는 inflammation과 관계된 프로스타글란딘의 합성의 key enzyme인 cyclooxygenase-2의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있습니다. 프로스타글란딘은 직접적으로 caspase 3의 활성화를 통하여 neurotoxic 할 수 있으며, 간접적으로 아스트로사이트에 의한 글루타메이트의 배출을 통해 neurotoxic 할 수 있다고 합니다. 프로스타글란딘 중 PGE2는 brain inflammation의 시작과 전파에 있어서 가장 유력한 인자 중 하나입니다. 발표된 논문에 의하면 PGE2의 합성을 줄이는 약물은 neuroinflammation model에서 신경보호효과를 보여주었습니다.

Effect of shogaol on other inflammatory mediators in primary microglia IL-1 TNF- *** *** *** *** LPS (100 ng/ml) – + + + + LPS (100 ng/ml) – + + + + 1 5 10 1 5 10 shogaol (M) shogaol (M)

LPS stimulated MAPK activation in microglial cells CD14 LBP TLR-4 P38 MAPK Gene Expression iNOS mRNA iNOS O2- NO Neuronal damage TNF IL-1

The effect of shogaol on MAPKs activation induced by LPS in primary microglia – – 10 10 shogaol (M) – – 10 10 LPS – + + – LPS – + + – p38 p-p38 Intensity 29 100 32 14 shogaol (M) – – 10 10 shogaol (M) – – 10 10 LPS – + + – LPS – + + – JNK p-JNK MAPKs는 NF-kB와 함께 활성화된 microglia에서 proinflammatory 물질을 합성하고 방출하는것을 조절하는 신호전달과정에서 가장 중요한 molecule입니다. 위의 결과에서 보면 LPS 30분 처리하면 p38, JNK, ERK 등의 모든 MAPK들이 activation되는 것을 확인 할 수 있습니다. 3가지의 MAPK 중에 p38, JNK 등이 microglia에서 LPS에 의한 염증반응에 중요한 역학을 합니다. 그림을 보면 p-p38은 shogaol을 처리하였을 때 control 수준으로 expression이 줄어드는 것을 확인할 수 있습니다. P-JNK는 shogaol 처리 후 약간 expression이 줄어듭니다. ERK는 약간 증가시키는 경향을 보여줍니다. 이 결과들을 종합해보면 shogaol은 주로 p38의 activation을 억제하여 항염증효능을 보여준다고 생각됩니다. AKT는 IkB의 degradation을 통해 NF-kB activation을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. LPS를 microglia에 처리하였을 때 AKT가 activation되는 것을 확인할 수 있습니다. Shogaol을 처리한 경우 AKT의 phospholation을 감소시키는 것을 확인하였습니다. Intensity 11 100 70 7.4 shogaol (M) – – 10 10 shogaol (M) – – 10 10 LPS – + + – LPS – + + – ERK p-ERK Intensity 49 100 106 61

The effect of PD98059 and SB203580 on NO production induced by LPS in primary microglia ** ** LPS (100 ng/ml) – + + + + + + + 1 5 10 1 5 10 PD98059 (M) SB203580 (M)

The effect of shogaol on AKT activation induced by LPS in primary microglia – – 10 10 shogaol (M) – – 10 10 LPS – + + – LPS – + + – AKT p-AKT Intensity 59 100 36 25 MAPKs는 NF-kB와 함께 활성화된 microglia에서 proinflammatory 물질을 합성하고 방출하는것을 조절하는 신호전달과정에서 가장 중요한 molecule입니다. 위의 결과에서 보면 LPS 30분 처리하면 p38, JNK, ERK 등의 모든 MAPK들이 activation되는 것을 확인 할 수 있습니다. 3가지의 MAPK 중에 p38, JNK 등이 microglia에서 LPS에 의한 염증반응에 중요한 역학을 합니다. 그림을 보면 p-p38은 shogaol을 처리하였을 때 control 수준으로 expression이 줄어드는 것을 확인할 수 있습니다. P-JNK는 shogaol 처리 후 약간 expression이 줄어듭니다. ERK는 약간 증가시키는 경향을 보여줍니다. 이 결과들을 종합해보면 shogaol은 주로 p38의 activation을 억제하여 항염증효능을 보여준다고 생각됩니다. AKT는 IkB의 degradation을 통해 NF-kB activation을 조절하는 것으로 알려져 있습니다. LPS를 microglia에 처리하였을 때 AKT가 activation되는 것을 확인할 수 있습니다. Shogaol을 처리한 경우 AKT의 phospholation을 감소시키는 것을 확인하였습니다.

Effect of shogaol on NF-B activity in activated primary microglia ** NF-B p65 DNA binding (%) NF-kB는 proinflammatory mediators에 대해 중요한 transcription factor입니다. Microglia에서 NF-kB의 억제는 iNOS, COX-2 그리고 IL-1beta, TNF-alpha 등의 cytokine들의 생성을 줄어들게 합니다. 이번 결과는 cytosol에 있는 NF-kB와 IkB를 western blot을 통해 확인한 것입니다. NF-kB가 핵안으로 들어가지 못하게 억제하고 있는 IkB는 LPS 처리하였을 때 phospholation되어 degradation 됩니다. LPS를 처리하였을 때 IkB가 줄어드는 것을 확인할 수 있습니다. 그로 인해 cytosol에 NF-kB가 없어지는 것을 확인하였습니다. Shogaol을 처리한 경우 IkB가 LPS처리 군에 비해 많이 늘었으며 또한 NF-kB의 경우에도 cytosol에 존재하고 있음을 확인하였습니다. 결과를 종합해서보면 shogaol은 microglia에서 NF-kB, MAPKs, AKT의 activation을 downregulation 해서 항염증효능을 보여주는 것으로 보입니다. Con LPS LPS Shogaol + Shogaol

NF-kB activation in microglial cells Injury Stress IKK IKK IKK IB p50 p65 TNF BDNF IB Positive Feedback Negative Feedback p50 p65 Nucleus

Effect of shogaol on NF-B activity in activated primary microglia – – 10 10 shogaol (M) – – 10 10 LPS – + + – LPS – + + – IB p-IB Intensity 100 19 52 84 NF-kB는 proinflammatory mediators에 대해 중요한 transcription factor입니다. Microglia에서 NF-kB의 억제는 iNOS, COX-2 그리고 IL-1beta, TNF-alpha 등의 cytokine들의 생성을 줄어들게 합니다. 이번 결과는 cytosol에 있는 NF-kB와 IkB를 western blot을 통해 확인한 것입니다. NF-kB가 핵안으로 들어가지 못하게 억제하고 있는 IkB는 LPS 처리하였을 때 phospholation되어 degradation 됩니다. LPS를 처리하였을 때 IkB가 줄어드는 것을 확인할 수 있습니다. 그로 인해 cytosol에 NF-kB가 없어지는 것을 확인하였습니다. Shogaol을 처리한 경우 IkB가 LPS처리 군에 비해 많이 늘었으며 또한 NF-kB의 경우에도 cytosol에 존재하고 있음을 확인하였습니다. 결과를 종합해서보면 shogaol은 microglia에서 NF-kB, MAPKs, AKT의 activation을 downregulation 해서 항염증효능을 보여주는 것으로 보입니다. Intensity 54 100 40 49

Effect of 6-shogaol on NO production induced by TLRs agonist in primary microglia cells. Nitrite (M) Nitrite (M) PamCSK - 10 100 1000 (ng/ml) Poly(I:C) - 0.25 2.5 25 (g/ml) (B) Nitrite (M) Nitrite (M) *** *** PamCSK - + + (1000 ng/ml) Poly (I:C) - + + (25 g/ml) 6-shogaol - - 10 (M) 6-shogaol - - 10 (M)

Effect of 6-shogaol post-treatment on NO production in LPS-stimulated primary microglia cells Nitrite (M) 6-shogaol (10 M) - - + - + - + - + 1 h 3 h 6 h 12 h LPS (100ng/ml) *** ** *

Effect of 6-shogaol on LPS-induced neurotoxicity in cortical neuron-glia cultures Control LPS LPS+6-shogaol 6-shogaol

Effect of 6-shogaol on microglial activation in LPS-induced cortical neuron-glia cultures Control LPS LPS+6-shogaol 6-shogaol Increaed cell size, Irregular shape, Intensified OX-42 staing

Effect of 6-shogaol on NO production in cortical neuron-glia culture Nitrite (M) Time (h) ***

2VO + Zingiberis Rhizoma (25 mg/kg) Neuroprotective effects of Zingiberis Rhizoma against ischemic brain injury Sham 2VO 2VO + Zingiberis Rhizoma (25 mg/kg) Nissl (Hippocampus - 100X, bar = 500 μm)

2VO + Zingiberis Rhizoma (25 mg/kg) Neuroprotective effects of Zingiberis Rhizoma against ischemic brain injury Sham 2VO 2VO + Zingiberis Rhizoma (25 mg/kg) CA1 - 400X, bar = 50 μm

Neuroprotective effects of Zingiberis Rhizoma against ischemic brain injury Cell viability in CA1 (% of sham) SHAM Vehicle Zingiberis Rhizoma (25 mg/kg) ischemia *P < 0.05, compare with Sham #P < 0.05, compare with vehicle treated 2VO control

2VO + Zingiberis Rhizoma (25 mg/kg) Neuroprotective effects of Zingiberis Rhizoma against ischemic brain injury Sham 2VO 2VO + Zingiberis Rhizoma (25 mg/kg) NeuN (200X, bar = 500 μm)

Neuroprotective effects of Zingiberis Rhizoma against ischemic brain injury Cell viability in CA1 (% of sham) SHAM Vehicle Zingiberis Rhizoma (25 mg/kg) ischemia *P < 0.05, compare with Sham #P < 0.05, compare with vehicle treated 2VO control

2VO + Zingiberis Rhizoma (25 mg/kg) Effect of Zingiberis Rhizoma on microglial activation in 2VO rats Sham 2VO 2VO + Zingiberis Rhizoma (25 mg/kg) OX-42 (200X, bar = 500 μm)

Effect of Zingiberis Rhizoma on microglial activation in 2VO rats OX-42+ cells (Number/mm2) SHAM Vehicle Zingiberis Rhizoma (25 mg/kg) ischemia *P < 0.05, compare with Sham #P < 0.05, compare with vehicle treated 2VO control

Neuroprotective effects of shogaol against ischemic brain injury Sham Ischemia Ischemia + 6-shogaol 10mg/kg NMMA 10mg/kg a) b) c) d) e) f) g) h) (A)

Neuroprotective effects of shogaol against ischemic brain injury Ischemia * * Cell viability in CA1 (% of sham) Sham Vehicle 1 3 10 10 6-shogaol (mg/kg) NMMA (mg/kg)

Effect of 6-shogaol on microglial activation in 2VO rats Ischemia + 6-shogaol 10mg/kg Ischemia + NMMA 10mg/kg Sham Ischemia a) b) c) d) e) f) g) h)

Effect of 6-shogaol on microglial activation in 2VO rats (B) ischemia OX-42+ cells (% of sham) * * Sham Vehicle 1 3 10 10 6-shogaol (mg/kg) NMMA (mg/kg)

LPS + Zingiberis Rhizoma 5mg/kg LPS + Zingiberis Rhizoma 20mg/kg Effect of shogaol and Zingiberis Rhizoma on the cortex in an in vivo LPS-induced neuroinflammation model control LPS 5mg/kg LPS + shogaol 5mg/kg LPS + shogaol 20mg/kg LPS + Zingiberis Rhizoma 5mg/kg LPS + Zingiberis Rhizoma 20mg/kg Bar=50um

Effect of shogaol and Zingiberis Rhizoma on the cortex in an in vivo LPS-induced neuroinflammation model LPS (5mg/kg) - + + + + + 5 20 5 20 (mg/kg) Shogaol Zingiberis Rhizoma

LPS + Zingiberis Rhizoma 5mg/kg LPS + Zingiberis Rhizoma 20mg/kg Effect of shogaol and Zingiberis Rhizoma on the hippocampus in an in vivo LPS-induced neuroinflammation model control LPS 5mg/kg LPS + shogaol 5mg/kg LPS + shogaol 20mg/kg LPS + Zingiberis Rhizoma 5mg/kg LPS + Zingiberis Rhizoma 20mg/kg Bar=50um

Effect of shogaol and Zingiberis Rhizoma on the hippocampus in an in vivo LPS-induced neuroinflammation model LPS (5mg/kg) - + + + + + 5 20 5 20 (mg/kg) Shogaol Zingiberis Rhizoma

Conclusion Ginger Anti-inflammatory effects (BV-2 cell, in vivo) Neuroprotective effects (ischemia model) Shogaol Anti-inflammatory effects (BV-2 cell, in vivo) NO, PGE2, IL-1, TNF-  iNOS, COX-2 expression  NF-B, p38, JNK, AKT  Neuroprotective effects (cortical neuron-glia cultures, ischemia model)

References A. Semmler et al., J Chem Neuroanatomy 30 144–157 (2005) Gehrmann et al., J Cereb Blood Flow Metab. 12, 257-269 (1992) Ryu et al., Glia. 38, 15-23 (2002) Akundi RS et al., Glia., 51(3):199-208 (2005) Surh Yj et al., Mutat Res., 480-481:243-68 (2001) Nakamura Y et al., Biol Pharm Bull., 25, 945-53 (2002)