MMP3 knock-out mice를 이용한 척수손상 이후 MMP 역할 및 메커니즘 연구

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1 MMP3 knock-out mice를 이용한 척수손상 이후 MMP 역할 및 메커니즘 연구
MMP-3 KO mice를 이용한 척수손상 이후 MMP역할 및 메커니즘 연구에 대하여 발표할 김효성입니다. 김 효 성

2 MMP3 KO HSP70 KO 척수 손상에 미치는 특정 유전자 기능 연구 Catalase KO GPX1 KO Wild type
저희 연구실에서는 척수 손상에 미치는 특정 유전자 기능을 연구하고자 C57BL strain의 Wild type과 HSP70, catalase, GPX1 MMP3 KO mice를 breeding하여 비교실험하고 있으며 이번에 저는 MMP-3를 이용한 특정 유전자 기능 연구에 대하여 발표하려고 합니다.

3 Spinal cord injury modeling
Before After Mouse를 이용한 spinal cord injury modeling을 위하여 laminectomy 이후 hemisection으로 손상을 주는 기술을 가지고 있으며 이렇게 만든 척수손상 모델 마우스를 통하여 molecular work과 immunohistochemistry work을 진행하고 있습니다. molecular work sampling Tissue section preparation

4 Other function : survival, angiogenesis, inflammation, signaling
MMPs (matrix metalloproteinases) : extracellular protease - ECM remodeling morphogenesis wound healing MMPs 에 대하여 간단히 설명 드리겠습니다. Matrix metalloprteinases는 Extracellular protease로서 morphogenesis, wound healing과 같은 extracellular membrane remodeling을 수행하며 그 외의 기능으로는 survival,angiogenesis, inflammation, signaling이 있습니다. Other function : survival, angiogenesis, inflammation, signaling

5 Name Enzyme Selected substrates MMP-1 Matrix collagenase
Collagens I, II, III, VII and X (fibroblast collagenase)  MMP-8  Neutrophil collagenase  Collagens I, II, III, Link protein, Aggrecan MMP-13  Collagenase 3  Collagens I, II, III MMP-18  Collagenase 4  Collagens I MMP-2  Gelatinase A  Gelatins, Collagens I, IV, VII and XI, Fibronectin, Laminin, Elastin  MMP-9  Gelatinase B  Gelatins, Collagens IV, V and XIV Aggrecan, Elastin MMP-3  Stromelysin 1  Aggrecan, Gelatin, Fibronectin, Laminin, Collagens III, IV, IX and X  MMP-10  Stromelysin 2  Aggrecan MMP-14  (membrane type)  Collagens I, II and III, Laminin MMP-7  Matrilysin  Aggrecan, Fibronectin MMP-11  Stromelysin 3  Fibronectin MMP-12  Metalloelastase (Macrophage)  현재 MMP는 20여종이 넘게 알려져 있으며 MMP-3형의 경우 stromelysin 1이라는 효소명으로도 불리우며 substrates로는 aggrecan, gelatin, Fibronectin, laminin, collagens 3,5,9,10 형이 있습니다.

6 MMPs MMPs 증가 Metalloproteinases in MS, CNS and EAE model
(1) Cellular source of MMPs in CNS Neuron astrocyte MMPs Microglia (2) Increase of MMPs in MS patients, EAE model 기존 연구에 의하면 CNS에서 astrocyte, microglia 심지어 neuron까지도 MMPs를 분비하였고 demyelination과 상관도가 높은 MS patients, EAE model에서 MMPs가 증가되었다고 합니다. 그리하여 MMPs가 신경계와 연계성이 있다는 생각을 하게되었습니다. demyelination MMPs 증가

7 Apoptotic neuron microglia
MMP3 Phagocytosis 그리고 결정적으로 위와 같은 논문에서 신경세포인 PC12 cell line에 자극을 주고 그 배지로 mice brain의 primary microglia cell을 배양한 결과 활성화가 되고 그것은 다시 neuron을 죽이는 결과를 보였습니다. microglia

8 Hypothesis Spinal cord Injury Functional impairment Neuronal Apoptosis
the release of MMP-3 from apoptotic neurons may activate microglia in SCI Spinal cord Injury Neuronal Apoptosis Apoptotic neuron Axon & Myelin Loss MMP3 위의 논문을 base로 하여 “SIC 이후 apoptotic neuron으로부터 MMP-3이 분비되고 이것으로 microglia가 activation되어 이후 Intrinsic CNS cells의 apoptosis를 촉진시키는것 아닌가?” 하는 가설을 세워봤습니다. 만약 이 가설이 맞다면 SCI 후에 microglia activtion이 매우 중요한데 아직 어떻게 activation이 되는지 모르는 문제를 해결할 실마리를 가지게 되는 것입니다. Microglia activation Oligodendrocyte Apoptosis Functional impairment

9 Question 1 : MMP3 가 없으면 SCI후 functional recovery가 향상될까?
그래서 그 문제를 직접적으로 파악하기 위하여 in vivo test를 통한 최종 결과부터 확인하여야 했습니다. 그래서 MMP3이 없으면 SCI후 fuctional recovery가 향상되는지를 살펴보았습니다.

10 BBB locomotor rating scale를 보며 최종 35일까지 wild type와 MMP3 KO를 비교한 결과 MMP3 KO가 wild에 비하여 2정이상 차이를 보이며 향상된 motor neuron recovery를 보였습니다.

11 Question 2 : MMP3 가 apoptosis를 일으키는데 관여할까?
BBB test를 확인한 후 MMP-3 유전자가 있을 경우에는 각 CNS cells 따른 apoptosis가 일어난다는 가설을 확인하기 위하여 TUNEL positive cell counting를 실시하였습니다.

12 Neuron cell이 가장 많이 죽는 1d와 oligodendrocyte가 가장 많이 죽는 5d로 time point를 설정하여 TUNEL positive cell을 counting한 결과 1d에서 wild type이 MMP-KO보다 많은 TUNEL positive cell rate를 보였으며 하단 모식도에서 보시는 바와같이 TUNEL positive signal은 injury site에 집중 분포하였습니다. 5d도 마찬가지로 wild type에서 많은 TUNEL positive signal이 관찰되었습니다. 또한 injury site뿐만 아니라 WM의 전체적 부분에서 signal이 관찰되었습니다. WT-1day KMMP3-1day WT-5day KMMP3-5day

13 Question 3 : How? (and further study)
최종적으로 가설의 결과를 이야기 함에 있어 어떻게 되는지 그 mechanism을 밝히려면 어떻게 해야할 것인지 그리고 그 이후 further study는 무엇을 해야하는지에 대하여 연구할 예정입니다.

14 Primary cell culture 메커니즘 이해를 통한 신약개발과 기초자료 제공 및 임상활용 모색 Neuron
Oligodendrocyte DRG Axon Microglia Apoptosis (DNA laddering) Degeneration Nitric oxide, Cytokine, ROS production, COX-2 expression B 앞으로의 계획을 간략히 말씀 드리면 최종적으로 mechanism study를 하기 위하여 MMP3 KO를 가지고 primary cell culture를 실시하여 개별적인 작용기작에 대하여 연구하고 이 연구를 통한 메커니즘 이해로 임상활용을 모색하고자 합니다. 더 나아가 MT와 cytosol을 구분하여 SCI에서의 세포소기관 역할을 further study로 잡고 있습니다. 감사합니다. 메커니즘 이해를 통한 신약개발과 기초자료 제공 및 임상활용 모색