액체크로마토그래피 (HPLC) High Performance Liquid Chromatography 동양공업전문대학 생명화공과 김 동 철

목 차 HPLC 의 기본원리 HPLC 의 기본 구성 HPLC 의 각 구성에 대한 원리

HPLC 의 기본원리

What is chromatography ? Chroma(color) + Graphein(write) 희랍어로 ‘색을 기록한다’는 의미. 혼합된 시료 성분이 이동상(mobile phase)과 고정상(stationary phase) 사이를 흐르면서 흡착, 분배, 이온교환 또는 분자 크기 배제작용 등에 의해 각각의 단일 성분으로 분리 하는 기술.

분리매체 • 고정상(Stationary phase = Column) ; 시료 성분들을 분리하는 관. • 이동상(mobile phase= 용매) ; 시료 성분들을 운반해 주는 용매.

HPLC 발전사

HPLC 발전사

HPLC 발전사

Chromatography 의 분류 Ion Exchange Gel Filteration Gel Permeation Gas Chromatography Liquid Chromato. Supherical Fluide Ch. Adsorption Partition Size Exclusion Ion Exchange Gel Filteration Gel Permeation

GC 와 HPLC의 차이점

HPLC 란? High Performance Liquid Chromatography (고성능액체크로마토그래피) : (고성능액체크로마토그래피) : 1개 이상의 혼합물(유기화합물)을 물리적으로 각각의 성분으로 분리하는 기술.

HPLC의H HPLC 분리원리 •흡착작용(adsorption); 고정상에 부착된 기능단에 시료가 흡착되어 각 성분을 분리. •분배작용(Partition); 고정상의 기능단이 역상으로 각 시료 성분들이 서로간의 분배로 분리. •이온교환작용(ion Exchange); 양이온이나 음이온의 시료가 상대 이온과의 경쟁으로 교환이 일어나 정지상에 분포.

HPLC 분리원리 • 분자체작용(Size Exclusion, Gel Permeation) ; 겔의 다공성 크기에 시료 분자의 크기에 따라 투과성(permeation)에 의해 분리하는 경우. 즉, 분자가 큰것이 먼저, 작은 것이 나중에 용리되는 원리. • 순상(Normal phase); 고정상(칼럼)이 이동상(용매) 보다 극성이 강한 경우. 극성이 큰 실리카 겔을 충진제로 사영할 때 실리카 표면 입자에 존재하는 Hydroxyl group(Si- OH)과 시료 상호간의 머므름 현상이 나타남.

HPLC 분리원리 • 역상(Reverse phase); 실리카 담체에 탄화수소(C18)를 결합시켜 비극성 충진물로 만들고 메탄올과 완충용액을 극성용매로 만들어 이동상으로 이용하여 분리하는 원리 . 극성이 큰 수용성 시료분석에 적합. - 대부분의 HPLC는 역상.

HPLC의 분리 원리 Normal Phase(순상): Adsorption (흡착작용) 분리관 극성, 비극성 용매 사용. 극성=고정상>이동상 Reverse Phase( 역상): Partition (분배작용) 분리관 비극성, 극성 용매 사용. 극성=고정상<이동상 Size Exclusion (분자체작용,크기배제) : 크기, 모양에 따라 분리. Ion Exchange (이온교환작용) : 이온 교환 작용에 의한 분리.

Normal Phase(Adsorption 흡착)

순상

Reverse Phase( Partition 분배)

역상

Size Exclusion (크기배제)

분자체 작용

Ion Exchange (이온교환) 이온성 화합물 및 무기이온의 분리에 사용. 음이온 교환체는 용질의 음이온과 인력이 상호 작용하며 양이온 교환체는 용질의 양이온과 상호작용.

이온교환

What is Chromatogram? • Chromatogram; 검출기(Detector)에 도달한 시료 성분은 전기적 신호 로 변환되어 이 신호를 도면으로 기록한 것을 크로마토그램.

HPLC 분리이론 Resolution : 분리능(Rs) Retention Time : 머무름 시간(tR), RT Selectivity : 선택도(α) Capacity factor : 분리계수(k´) Efficiency : 분리효율(N) (N=Theoretical Plate Number)

머무름 시간(RT), 머무름 부피

Efficiency : 분리효율(N) N은 칼럼 효율이며,칼럼 효율은 이론단수(N)로 표시. 최소 N값은 3,000 이상.

Selectivity : 선택도(α),분리계수 α 는 컬럼에서 용출되는 각 성분의 분리의 차이, separation factor α =1, 두 시료가 전혀 분리가 안됨 α >1, 두 시료가 분리되며, α 크면 클수록 두 시료의 분리는 좋아진다.

Capacity factor : 분리계수(k´) k´는 시료가 컬럼의 고정상에 충분히 머무르게 하는 효과,(VR) k´=0, 시료가 컬럼에 전혀 머무르지 않고 V0에서 용출 k´=1, 시료가 V0의 2배 되는 곳에서 용출 2≤ k´≤6, 시료가 적합하게 용출

Resolution : 분리능(Rs) Rs = 선택도 분리효율 분리계수 선택도 분리효율 분리계수 Rs는 비슷한 성질을 갖는 성분들의 분리 정도를 정량적으로 나타내는 값. Rs >1.5 분리능이 좋고, Rs <0.75 분리능이 떨어짐.

HPLC로 할 수 있는 일은 무엇인가요? 시료의 특성에 따라 정량, 정성 및 분취 가 가능 하다. 시료의 특성에 따라 정량, 정성 및 분취 가 가능 하다. 정량은 크로마토그램의 Peak 면적을 이용하여 가능. 정성은 크로마토그램의 Peak Retention time을 통하여 가능. 많은 량의 시료를 고 순도의 단일 물질의 분리에도 많이 사용. Voltage 시료가 분리되어 나오는 시간(retention time =RT)

HPLC 의 기본구성

HPLC의 모식도

HPLC의 각 부분의 역할 1. 용매 이송 장치 ( Eluent Delivery Pump) - 시료 이송 및 분리를 위한 Solvent 를 이송 하는 역할 2. 시료 주입 장치 ( Injector) - 시료를 분리 관으로 보낼 수 있도록 하는 역할 3. 분리 관 ( Separation Column) - 혼합된 시료들을 단일 물질들로 분리 하는 역할 4. 검출기 ( Sample Detector) - 분리된 단일 시료들의 존재 여부를 확인하는 역할 5. 데이터 수집장치(Data system ) - 검출기에서 확인된 시료를 전기적인 신호로 전환하여 크로마토그램 을 표시하는 역할

HPLC 각 구성에 대한 원리

Solvent (용매:이동상)조건 Solvent viscosity 가 낮아야 한다. 두 용매를 사용할 경우 혼합성이 서로 좋아야 한다. Solvent 에 의한 충진물이 녹아서는 않된다. 분석물질은 반드시 Solvent 에 녹아야 한다. Solvent 의 UV Cut-off, RI 값이 낮아야 한다. 낮은 b.p 를 갖아야 한다.

Solvent Strength (용매 강도) 용매강도는 역상, 순상에 따라 서로 반대의 강도를 가지며, 유기용매와 물의 혼합시 물의 함량이 많을수록 성분의 머무름 시간(Retention Time) 은 길어짐. Solvent Strength Reversed Phase Water DMSO Methanol Acetonitrile Tetrahydrofuran Normal Phase Haxane 1-Chlorobutane Methylene Chloride Acetonitrile

Solvent Delivery Pump(펌프)

Isocratic 과 Gradient 의 차이점 (특징: 재 현 성이 매우 좋다) Eluent A: 20%(Start) – 20%(end), Eluent B: 80%(start) - 80%(end) Gradient(기울기 용매 이송) : 분석 시간 동안 용매의 조성 비율이 변하는 이송 방식. (특징:분석 방법을 쉽게 찾을 수 있으나, 재현성이 매우 떨어진다) Eluent A: 20%(Start) – 80%(end), Eluent B: 80%(start) - 20%(end)

Injector(주입기) Manual Injector Autosampler

Injector 의 원리

Column(고정상)

Column(고정상)

Packing Material(충진제)

충진제 입자 크기

Detector(검출기) 굴절률 검출기 (RI Detector) UV/Vis 검출기 형광 검출기

Detector(검출기)

UV/Vis 검출기 사용범위 HPLC 검출기 중 가장 많이 사용. 분자구조내에 Aromatic Ring , Double Bond, Triple Bond , UV 유도체를 갖고 있는 화합물. 사용이 간편하고, Baseline 안정화 시간이 짧다. Functional Group Chromophore Wavelength (nm) Ether Olefins Thioether Amine Thiol Disulfide Bromide Iodide Azide -O- -C=C- -S- -NH2 -SH -S-S- -Br -I >C=N- 185 194 215 195 255 208 260 190 Ketone Thioketone Esters Aldehyde Carboxyl Nitrite Oxalic Acid Azo Nitroso Nitrate >C=O >C=S -COOR -CHO -COOH -ONO HOOC-COOH -H=N- -N=O -ONO2 270-280 205 280-300 200-210 220-230 300-400 250 285-400 302 270

굴절율 검출기 (Refractive Index Detector) 원리 Reference Cell 과 Sample Cell 에 포함된 시료와 용매의 굴절율 차이에 의하여 검출 온도, 밀도 , 청결 상태 등에 영향을 받는다.

형광검출기 (Fluorescence Detector) 원리 시료의 분자 구조가 형광성을 띠거나, 형광 유도체를 만들었을 때 이용된다. 사용범위 Polycyclic Aromatic , Aflatoxin 류 , Amino Acid 생화학 , 의학 , 공중보건 , 약리학 , 석유화학분야 UV 검출기 보다 100배 ~ 1000배 선택성이 있다. (감도좋다.)

녹차의 HPLC분석(예시) Catechine Standard

녹차의 HPLC분석(예시) Epigallocatechine gallate Standard

녹차의 HPLC분석(예시) 태평양 녹차 티백 희석배수Ⅹ100

녹차의 HPLC분석 결과 시험항목 시간 시료 비고 Catechine 30초 4.16mg 1분 4.56mg 10분 6.24mg Isoflavone 0.55mg EGCG 3분 불검출 카텍신 1일 권장량은 500~1000mg. 결론, 1티백 보다 다량 끊여서 마시는 것이 좋다.

Vit-C의 HPLC정량 표준용액의 조제(ST) 시료의 조제(SA) Ascorbic acid 비타500 10.0mg 5ml H2O qs H2O qs 100ml 100ml

Vit-C 분석조건 및 계산 분석조건 Column(Stationary Phase) ; u-Bondapak C18 Mobile phase; 0.05M KH2PO4: ACN= 60:40 Flow rate; 1.0ml/min Detector; 254nm SA peak area ☓ ST취한량 평균중량 %= ☓희석배수 ☓ ☓역가 ST peak area ☓ SA취한량 기준량