PCR과 Electrophoresis를 이용한 chromosomal DNA의 복제 및 분석 화공생명공학과 20031178 손경희

목 차 실험목적 PCR 전기영동 실험결과 (Data) Primer 설계

1. 실험목적 cDNA의 특정 부분을 복제, 증폭하는 과정을 통해 PCR의 원리와 장치 조작법을 익힌다. 전기 영동법의 원리를 이해하며, 장치의 조작 방법을 습득한다.

2. PCR (Polymerase Chain Reaction) : 특정 DNA 부위를 반복 합성하여 원하는 DNA분자를 증폭시키는 방법 ① denaturation : 증폭하고자 하는 DNA를 열 변성시켜 상보적인 DNA 가닥을 만드는 과정 ② annealing : 온도를 낮추어 Primer가 양쪽의 상보적 가닥에 수소결합할 수 있도록하는 과정 ③ elongation : DNA 중합효소가 디옥시뉴클레오티드 삼인산을 사용해 표적 DNA의 복사본을 합성하는 과정

이론적으로, n회의 cycle을 통한 표적배열은 2^n배

PCR 시약 ①표적 DNA ②프라이머 (충분한 양) ③DNA 중합효소 (Taq polymerase) ②프라이머 (충분한 양) ③DNA 중합효소 (Taq polymerase) ④데옥시뉴클레오티드 삼인산 (4가지;dATP,dTTP,dGTP,dCTP) http://www.genocheck.com/genocheck/html/product/real_pro.php

PCR 기기

※ PCR 온도 설정 변성(denaturation) 온도 : DNA 이중결합을 이루는 염기들 간의 결합을 파괴하여, DNA 합 성을 위한 주형으로 작용할 수 있도록 단일 사슬로 만드는 온도로서 일 반적으로 94℃이다. 결합(annealing) 온도 : primer가 주형에 결합하는 온도로서 주형에 따라 다르다. 신장(elongation) 온도 : DNA 가 합성되는 온도로서 Taq 중합효소의 적정 온도보다 약간 낮은 74℃이다.

PCR의 결합 온도는 각 primer들의 Tm값을 계산함으로써 결정되며 대개 이보다 1-2 ℃ 낮은 온도를 이용한다. Annealing 온도 결정 결합 온도는 primer와 주형간의 결합이 가능할 정도로 충분히 낮아야 하지만, 잘못된 염기쌍의 형성을 방지할 수 있을 정도로 충분히 높아야. Primer, 주형 결합체의 Tm에 따라 결정되며, 이는 실험적으로 결정될 수 있으나 보통 간단한 공식으로 부터 계산한다. Tm = 4*(G+C)+2*(A+T) (G+C)는 primer에 존재하는 G와 C뉴클레오티드의 개수이고, (A+T)는 A와 T의 개수이다.   PCR의 결합 온도는 각 primer들의 Tm값을 계산함으로써 결정되며 대개 이보다 1-2 ℃ 낮은 온도를 이용한다.

Primer와 Taq polymerase는 얼려서 보관 실험 시 주의사항 Primer와 Taq polymerase는 얼려서 보관 Taq를 사용할 때에는 Taq가 담겨있는 튜브가 아이스 밖으로 나오지 않도록 주의한다. (2) 마이크로 피펫 사용시, 눈금 범위 밖으로 돌리지 않고, 용액이 담긴 상태로 피펫을 거꾸로 세우지 않는다. (3) 피펫은 항상 스탠드에 세워두도록 하며, pippet tip의 케이스는 이물질이 들어가지 않도록 항상 닫아둔다.

PCR의 이용 예 임상검사-암세포 유무의 진단 감염증-병원체 존재의 진단 태아의 성별 진단 법의학-개인의 특징 확인

3. Electrophoresis 전기장 안에서 하전된 입자가 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상을 이용 이동하는 속도는 입자의 전하량과 크기, 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기 등 여러 가지 요인에 의해 결정된다. 어떤 용액에서 하전된 알맹이의 이동속도는 분자 자체의 성질에 따라 다르고, 이를 통해 물질을 분리 할 수 있다. ▶ 아미노산, 뉴클레오티드, 단백질과 같은 하전된 물질들을 분리하거나 분석하는 데 매우 효과적인 수단으로 이용된다.

밀도, 원심분리로 분리할 수 없는 DNA조각들의 혼합물 분리가능 형광성 시약으로 처리하면 자외선 하에서 DNA 직접 관찰가능 ※ Agarose gel 전기영동법 : 간단, 신속 밀도, 원심분리로 분리할 수 없는 DNA조각들의 혼합물 분리가능 형광성 시약으로 처리하면 자외선 하에서 DNA 직접 관찰가능 → 큰 거대 분자와 그 복합체인 바이러스, 효소 복합체, 지질단백질(lipoprotein), 핵산(nucleic acid)등의 전기영동에 이용되고 있다.

*Agarose gel 전기영동시 DNA의 이동에 영향을 주는 요인들* 4) 부하되는 전압 ↑ → 이동속도 ↑ 5) 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다. 6) 전기영동 완충용액의 성분과 이온세기도 전기영동 속도에 영향

전기영동 시약 ① TAE buffer ② Agar ③ ladder ④ loading dye - ⅰ) 높은 밀도 -> DNA를 well내에 안착하게 함 ⅱ) 염색성분을 가지므로 loading정도를 눈으로 확인가능 ⑤ EtBr (ethidium bromide) - 대표적인 DNA염색물질로, 전기영동을 통한 DNA의 확인에 사용된다. <발암물질이므로 주의>

실험 시 주의사항 (1) EtBr은 발암물질이므로 신체에 닿지 않도록 각별히 주의를 기울이고, 관련 기기와 소모품들은 특별관리 및 처분한다. (2) UV광학기의 자외선을 눈으로 직접 쐬지 않도록 주의한다. (3) 만들어진 Agarose gel에 시료를 주입할 때, 피펫의 끝이 다른 곳을 찌르지 않도록 주의하고, 90도 직각아래로 너무 깊숙이 찌르지 않도록 하며, 천천히 주입한다. (4) 전기영동 tank와 gel은 동일한 전기영동 완충액을 사용해야 한다. (5) agarose 용액을 주형에 부을 때, 기포가 생기지 않도록 주의한다.

4. 실험결과 mgsA : 421bp gldA : 1081bp 1kb 500bp 200bp < 전기영동 결과 : ladder, gldA, mgsA, mgsA, gldA (왼쪽부터) >

5. Primer 설계 <gldA> atggaccgca ttattcaatc 1 atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt 61 ctgggcgaat acctgaagcc gctggcagaa cgctggttag tggtgggtga caaatttgtt 121 ttaggttttg ctcaatccac tgtcgagaaa agctttaaag atgctggact ggtagtagaa …… 961 aaaatgcgaa ttgtggcaga agcggcatgt gcagaaggtg aaaccattca caacatgcct 1021 ggcggcgcga cgccagatca ggtttacgcc gctctgctgg tagccgacca gtacggtcag 1081 cgtttcctgc aagagtggga ataa aggacg ttctcaccct tatt Primer의 길이 : 20mer로 함 (Primer의 길이는 20~25bp가 적당) 각각의 Tm 이 56℃와 58℃가 나왔다.

primer의 Tm값을 최적 온도인 55℃에 근접하게 맞추는 데에 초점을 두어, 뒤쪽에 cat 뉴클레오티드를 삽입 atggaccgca ttattcaatc 1 atggaccgca ttattcaatc accgggtaaa tacatccagg gcgctgatgt gattaatcgt 61 ctgggcgaat acctgaagcc gctggcagaa cgctggttag tggtgggtga caaatttgtt 121 ttaggttttg ctcaatccac tgtcgagaaa agctttaaag atgctggact ggtagtagaa ……….. 961 aaaatgcgaa ttgtggcaga agcggcatgt gcagaaggtg aaaccattca caacatgcct 1021 ggcggcgcga cgccagatca ggtttacgcc gctctgctgg tagccgacca gtacggtcag 1081 cgtttcctgc aagagtggga ataa cat acg ttctcaccct tatt gta PCR의 길이 : 20mer로 함 Tm 이 56℃로 동일하게 나왔다.

즐거운 여름방학 되세요~~