생명과학 실험기법 세포배양 이론 및 방법: 세포배양법 2017년 10월 13일 Dept.of Life Science, Gachon University 세포배양 이론 및 방법: 세포배양법 2017년 10월 13일

세포배양법 I. Cell Culture Basics

Ross Granville Harrison (1870-1959) 1. What is Cell Culture? 역사 - 1885: Roux maintained embryonic chick cells in a saline culture. - 1907: Harrison cultivated frog nerve cells in a lymph clot held by the 'hanging drop' method and observed the growth of nerve fibers in vitro for several weeks. He was considered by some as the father of cell culture. - 1952: Gey established a continuous cell line from a human cervical carcinoma known as HeLa (Helen Lane) cells. Dulbecco developed plaque assay for animal viruses using confluent monolayers of cultured cells. 목적 - 의악연구 (백신, 암) - 기초연구 (세포융합, 유전자 주입, 핵치환) - 유전공학 (치료단백질 대량생산) - 동물보호운동 Ross Granville Harrison (1870-1959) 장점 - 세포특성 규명 및 동일성 유지, 경제성, 규모, in vivo Modeling 단점 - 전문성의 필요, 환경조절 필수, 세포 생산량과 비용, 유전적 표현형적 불안정성 George Otto Gey (1899–1970)

HeLa was the first human cell line established in culture (Gey et al Jonathan L, et al. The genomic and transcriptomic landscape of a HeLa cell line. G3: Genes, Genomes and Genetics, 2013

Type of Cell Cultured in vitro (1) Primary culture - Derived directly from animal tissue embryo or adult? Normal or neoplastic? - Cultured either as tissue explants or single cells - Initially heterogeneous – become overpopulated with fibroblasts - Finite life span in vitro - Retain differentiated phenotype - Mainly anchorage dependant - Exhibit contact inhibition (2) Established cell line culture - Derived from a primary or secondary culture - Immortalized: Spontaneously (e.g., spontaneous genetic mutation) By transformation vectors (e.g., viruses and/or plasmids) - Serially propagated in culture showing an increased growth rate - Homogeneous cell population - Loss of anchorage dependency and contact inhibition - Infinite life span in vitro - Differentiated phenotype: Retained to some degree in cancer derived cell lines Very little retained with transformed cell lines - Genetically unstable Note: Contact inhibition 이란? Cell population이 증가하여 세포끼리 조밀하게 맞닿을 경우 세포의 성질에 변화를 주고 성장이 방해 받는 현상

Morphology of Cells in Culture (1) Fibroblastic (or fibroblast-like) : cells are bipolar or multipolar, have elongated shapes, and grow attached to a substrate. (2) Epithelial-like : cells are polygonal in shape with more regular dimensions, and grow attached to a substrate in discrete patches. (3) Lymphoblast-like : cells are spherical in shape and usually grown in suspension without attaching to a surface. Fibroblastic Epithelial Lymphoblast

미생물의 오염 방지가 최우선 과제  무균조작법 + 무균의 공기, 배지, 용기, 기기 Cell Culture의 과정 세포주 해동 배양용기에서 growth preservation thawing 조직으로부터 세포분리 Note: Passage number - The number of times the cells have been removed (or “split”) from the plate and re-plated. Always write this on your plate or flask as P# 세포배양의 준비 - 배양의 목적은 실험에 이용하는 세포를 배지 중에서 증식시키는 것 - 가장 주의를 요하는 것은 미생물 (세균, 곰팡이, mycoplasma 등)의 오염을 피하는 것 - 배양 환경을 가능한 무균 상태로 유지하고, 무균 조작을 함으로써 달성 미생물의 오염 방지가 최우선 과제  무균조작법 + 무균의 공기, 배지, 용기, 기기 세포주의 구입 - 미국: American Type Culture Collection (ATCC) http://www.atcc.org - 한국: Korean Cell Line Bank (KCLB) http://cellbank.snu.ac.kr

ATCC (www.atcc.org)를 통해 HeLa Cell을 검색한 결과

2. Cell Culture Equipment 기본장비 - Cell culture hood (laminar-flow hood or biosafety cabinet) - Incubator (humid CO2 incubator reccommended) - Water bath - Centrifuge - Refrigerator and freezer (-20℃) - Cell counter (Automated Cell Counter or hemacytometer) - Inverted microscope - Liquid nitrogen (N2) freezer or cryostorage container - Sterilizer (i.e., autoclave) 추가장비 - Aspiration pump (peristaltic or vacuum) - pH meter - Confocal microscope - Flow cytometer 기타물품 및 시약 - Cell culture vessels (flasks, Petri dishes, roller bottles, multi-well plates) - Pipettes and pipettors - Syringes and needles - Waste containers - Media, sera, and reagents - Cells

(1) Biosafety cabinet의 종류 및 특징 Clean Bench Fume Hood 생물안전 작업대 - Class I - Class II Type A1 Type A2 / Type A2 (Exhausted) Type B1 / Type B2 - Class III

Clean Bench

Fume Hood

Biosafety Cabinet: Class II A2 - BSC Class II A형은 샘플, 사람, 환경 모두 보호함. - HEPA filter를 통해 70% 재순환하며, 30%는 외부로 배기됨. - 음압에 의해 공기의 유입이 형성됨.

(3) Inverted microscope (2) CO2 incubator 액상 배지의 한 성분인 NaHCO3와 CO2 기체와의 평형에 의해 배지의 pH가 조절되므로 동물 세포 배양에는 CO2 incubator가 필수적임. 세포배양에 사용되는 CO2 incubator의 대부분은 water jacket 형으로서 문의 개폐에 따르는 온도변화가 작고 복귀속도도 빠르다. Incubator 내부 가장 아래에는 배지의 습기 증발을 막기 위해서 가습 vat이 있어야 하며 늘 멸균수를 채워 넣어 내부 습도를 100%로 유지 CO2 incubator는 고온다습하여 잡균의 오염가능성이 크기 때문에 무균 상태를 유지하도록 주의 (3) Inverted microscope 배양기 안에서 배양하고 있는 세포를 관찰하기 위하여 광원이 위에 있고, 대물렌즈가 아래에 위치 배율 : 40~200배

3. Aseptic Technique Clean bench는 작업대의 바닥 및 벽, 유리윈도스크린 등을 소독용 에탄올로 정기적으로 소독해 주어야 한다. 또한, 엎질러진 배지의 얼룩은 완전히 제거하고 세포배양시에 관련되는 모든 유리병 및 피펫 등도 소독용 알콜솜으로 소독해준다. Clean bench에서 작업할 때 병이나 플라스크의 입구나 마개 등은 병이나 플라스크를 열기전 및 닫기전에 불로 소독 (flaming)해야 한다. Flaming에 가장 많이 사용되는 것으로는 알콜램프, 분젠버너 등이 있으며 분젠버너에는 터치식 및 자동센서식이 있다. 또한, 유리 피펫도 사용하기 전에는 flaming을 가볍게 하여 피펫의 외부를 소독하여 미생물의 오염을 최소화 하도록 한다. 소독용 ethanol의 농도 - 무균 조작 시 사용하는 ethanol의 농도는 70%가 일반적이다. 분무기에 미리 준비하여 사용하는 것이 좋으며 70% ethanol을 뿌려 소독한 후에 남아있는 잔여물은 핸드타올 (예, 킴와이프스)로 닦아낸다.

Sterile Handling Always wipe your hands and your work area with 70% ethanol. Wipe the outside of the containers, flasks, plates, and dishes with 70% ethanol before placing them in the cell culture hood. Avoid pouring media and reagents directly from bottles or flasks. Use sterile glass or disposable plastic pipettes and a pipettor to work with liquids, and use each pipette only once to avoid cross contamination. Do not unwrap sterile pipettes until they are to be used. Keep your pipettes at your work area. Always cap the bottles and flasks after use and seal multi-well plates with tape or place them in resealable bags to prevent microorganisms and airborn contaminants from gaining entry. Never uncover a sterile flask, bottle, petri dish, etc. until the instant you are ready to use it and never leave it open to the environment. Return the cover as soon as you are finished. If you remove a cap or cover, and have to put it down on the work surface, place the cap with opening facing down. Use only sterile glassware and other equipment. Be careful not to talk, sing, or whistle when you are performing sterile procedures. Perform your experiments as rapidly as possible to minimize contamination.

4. Cell Culture Basics Cell growth의 요구 조건 - pH : 7.4 ~ 7.7 Phenol red indicator Cell growth의 요구 조건 - pH : 7.4 ~ 7.7 - Gas : CO2(5%), O2 - Osmolality : 260~320 mOSm/kg - Temperature : 37℃ - 기타 : 수분 및 증식할 수 있는 충분한 공간 배지의 기본 조건 1) pH : 대부분의 세포는 pH 7.4에서 가장 잘 배양되며, 세포의 특성에 따라 조금씩 다르지만 대부분 적정 pH는 7.0~7.7임. 배양액의 pH 번화를 파악하기 위하여 phenol red를 첨가되어 있는 경우가 일반적임. 2) CO2 와 Bicarbonate : Cell은 성장과 생존을 위해 적은 양의 CO2를 생산하고 필요로 함. Culture 배지에 녹은 CO2는 bicarbonate ion과 평형상태에 놓이며, 많은 배지 조성성분은 배지의 pH를 완충하기 위해 CO2 /bicarbonate 반응을 이용함. 3) 완충액 (buffering) : 극심한 pH의 변화가 없게 하기 위해서 완충작용을 가진 배양액을 사용하며, 이 때 완충제로 bicarbonate나 HEPES가 있는데 이들은 모두 CO2 와 화학적으로 반응하여 완충작용을 함. 4) 영양성분 : 대부분의 배지에는 20가지 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 비타민, 염류, 포도당, 유기화합물, 호르몬 및 성장인자, 항생제 등이 포함됨. 혈청을 열처리 불활성화한 후 사용하는 것이 대부분이며, 세포의 종류에 따라 배지 내 첨가량 (약 2~20%)이 달라짐.

혈청의 열 불활성화 (heat-inactivation) 혈청의 종류 - 조직 및 세포배양에서 가장 많이 사용되고 있는 혈청은 FBS (fetal bovine serum)과 FCS (Fetal calf serum)으로 FCS는 대개 16개월된 송아지에서 혈청을 채취한 것으로 FBS에 비해 단백질의 양이 2배에 달하고 항체 또한 약 100배 정도 많이 함유되어 있음. 일반적으로 FBS를 더 많이 사용하고 있음. - Charcoal stripped serum은 혈청 내 여러 성분들이 제거되어 있으며, 이중에는 estrogen과 같은 lipid-soluble factor (steroid hormones, thyroid hormones 등)의 제거도 포함됨. 예) Estrogen starvation과 같은 실험을 위해서는 dextran-charcoal treated fetal bovine serum (DCC-FBS)를 포함한 phenol red-free medium을 사용해야 함. (Phenol red is a weak estrogen mimic, and in cell cultures can enhance the growth of cells that express the estrogen receptor.) 혈청의 열 불활성화 (heat-inactivation) - Heat inactivation이란 혈청 속의 Complement protein이나 Mycoplasma를 제거하는 과정임. 그러나이 과정 동안 다른 유용한 amino acid, vitamins, growth factor들도 파괴될 수 있음. - 냉동 상태의 FBS를 하루 또는 이틀전 냉장에서 서서히 녹인 후, 56°C의 water bath에서 30분 동안 incubation 해줌. 이때 침전물이 생기지 않도록 10분마다 가볍게 뒤집거나 흔들어줌. - Heat-inactivation이 끝난 FBS는 50ml centrifuge tube에 50ml 씩 분주하고, -20℃에서 보관

항생제 (Antibiotics) - Penicillin, streptomycin, gentamicin, amphotericin B - Reduce the risk of bacterial and fungal contamination - Cells can become antibiotic resistant – changing phenotype - Preferably avoided in long term culture Gibco® Antibiotic-Antimycotic is used to prevent bacterial and fungal contamination. This solution contains 10,000 units/mL of penicillin, 10,000 µg/mL of streptomycin, and 25 µg/mL of Fungizone® (amphotericin B) Antimycotic.

세포의 오염 - Mycoplasma 세포배양시 가장 흔하게 오염되는 미생물의 일종으로, 오염될 경우 세포증식, 대사 및 분화 등에 심각한 영향을 줌. 오염 사실을 확인하기 어려우며, 일반 항생제로 제거가 어려움. - Bacteria - Yeast

부착세포 (adherent cells)와 부유세포 (suspension cells) - 대부분의 고형 조직 유래의 세포는 단층으로 부착하여 증식 - 이러한 세포는 대부분 약한 음전하를 띤 유리 용기 또는 적당한 전하를 띄도록 처리된 polystyrene과 같은 플라스틱 용기에 부착하여 증식 - 세포의 부착은 extracellular matrix (ECM) protein에 대한 specific cell surface receptor에 의해 매개 - 부착 세포에는 fibroblast-like cell, endothelial cell, epithelial cell, mesenchymal cell 등이 해당되고 어떤 경우에든 부착하기 전에 세포로부터 ECM protein이 합성 및 분비되어야 하며 그렇지 않을 경우에는 표면이 ECM protein으로 처리된 substrate가 제공되어야 함. - Cell-cell그리고 cell-substrate의 부착은 cell surface receptor와 ECM protein에 의해 이루어지며 이 과정에서 Ca2+이 중요하게 작용 - 계대 배양 시 protein의 분해와 Ca2+ chelation을 이용하는 경우가 많음.

(2) 부유세포 (suspension cells) - Leukemia와 murine ascite tumor cell들은 지속적으로 부유 상태로 증식하며, 부유 세포 배양은 세균과 유사하게 계대 배양함. - 탈착 과정 (trypsin 처리 등)을 필요로 하지 않으며 전체적으로 부착보다 시간이 더 적게 소요됨. - 세포를 유지하기 위해서는 주로 배양 세포를 희석시킴으로서, 또는 계대 배양없이 단순히 배지의 양을 증가시킴으로써 지속적으로 배양 가능 - 부유 배양에서는 배양액의 희석을 지속적으로 하여 세포 농도가 항상 일정하도록 유지할 수 있다면 세포 증식의 steady state에 도달 가능

세포의 성장곡선

Lag phase (유도기, induction phase) - 세포를 새로운 배지에 접종, 배양할 때 그 배지에 적응하는 시기 - 세포가 새로운 환경에서 증식하는데 필요한 각종 효소단백질을 생합성하는 시기 - 세포의 크기가 커지고 호흡활성도가 높은 시기 - 세포내의 RNA량은 현저하게 증가하고 효소단백질 합성이 왕성한 시기 (DNA량은 변화하지 않음)   (2) Logarithmic phase (대수기, exponential phase) - 세포가 대수적으로 증식하는 시기 - 세대시간, 세포의 크기가 일정한 시기 - 세포질의 합성속도와 세포수의 증가는 비례 - 증식속도는 배지의 영양, pH, 온도, 산소분압 등의 환경인자에 의해서 결정 - 세포의 생리적 활성이 가장 강한 시기 - 물리적, 화학적 처리에 대해서 감수성이 높은 시기 (3) Stationary phase (정상기, maximum phase) - 살아있는 세포의 수는 일정하게 유지되지만 전세포수는 최대가 되는 시기 - 일부 세포가 사멸하고 다른 일부의 세포는 증식하여 사멸수와 증식수가 거의 같다. - 영양물질의 고갈, 대사생산물의 축적, 배지 pH의 변화, 산소공급의 부족 등 부적당한 환경이 되어 살아있는 세포수가 증가하지 않는다. (4) Death phase (사멸기, phase of decline) - 살아있는 세포의 수가 감소하는 시기

5. Cell Culture Protocols (1) Cell thawing [사전준비] ① 배지 구분 시약명 용량 보관장소 조치사항 Growth medium RPMI-1640 500ml 4℃ Pre-warm (37℃) FBS 50ml 20℃ 100X Anti-anti 5ml *배지는 미리 필요한 양만큼 만들어서 4℃에 보관하도록 하며, 실험 30분전 37℃ water bath에 넣어 pre-warm. ② 물품 - 100Φ dish - 15ml centrifuge tube - 15ml centrifuge tube rack - Disposable pipet (5ml, 10ml) - Aspirating pipet (plastic) or Pasteur pipet (glass, autoclaved) - Pipet aid - Pipet (1000μL) - Pipet tip (1000μL) - Latex glove - Lab coat - 70% ethanol sprayer - Hand towel - Cell stock (in LN2 tank)

[실험방법] Heat a water bath to 37°C, and prewarm the growth medium into which the cells will be plated. Add prewarmed growth medium to an appropriately sized cell culture vessel. Remove the cryovial containing the frozen cells from liquid nitrogen storage and immediately place it into a 37°C water bath. Quickly thaw the cells (< 1 minute) by gently swirling the vial in the 37°C water bath until there is just a small bit of ice left in the vial. Transfer the vial it into a laminar flow hood. Before opening, wipe the outside of the vial with 70% ethanol. Transfer the thawed cells dropwise into the centrifuge tube containing the desired amount of pre-warmed complete growth medium appropriate for your cell line. Centrifuge the cell suspension at approximately 200 × g for 5–10 minutes. The actual centrifugation speed and duration varies depending on the cell type. After the centrifugation, check the clarity of supernatant and visibility of a complete pellet. Aseptically decant the supernatant without disturbing the cell pellet. Gently resuspend the cells in complete growth medium, and transfer them into the appropriate culture vessel and into the recommended culture environment. Note: The appropriate flask size depends on the number of cells frozen in the cryovial, and the culture environment varies based on the cell and media type.

배양세포의 증식 특성 • 세포들은 일정량의 영양성분을 일정 공간 내에서 공급받으며 증식하고 contact inhibition의 특징을 가지고 있기 때문에 무한정 배양이 불가능하다. 따라서 세포들을 계속 증식시키기 위해 세포 일부를 배양용기에서 떼어내어 새로운 배양접시에 넣고 배양을 하는 sub-culture를 필요로 한다. • 대부분의 세포는 분열횟수가 증가함에 따라 세포노화(culture senescence) 현상이 나타나고 세포의 성질이 시간에 따라 변화하기 때문에 일정 횟수만큼만 subculture를 할 수 있다. 하지만 돌연변이에 의해 세포 성질이 변하여 장기간 subculture가 가능해진 세포가 있을 수 있는데 이를 cell strain, 무한정 subculture가 가능해진 세포를 cell line이라고 한다. • Sub-culture는 배양액의 pH, 세포밀도, 세포형태나 색소·기포형성 등을 관찰하여 그 시기를 결정한다. 1. 부유세포주 (pipetting) : 원심분리 → 배지교환 → 계수, 희석 → 접종 (10ml/100mm dish) 2. 부착세포주 (효소처리) : DPBS → Trypsin/EDTA 2-10분 → 배지 첨가 → 원심분리 → 배지 교환 → 계수, 희석 → 접종 Note: 세포주 계대배양의 주의점 (1) 계대 timing : towards end of log phase (2). 희석율 : 1:4 ~ 1:16 (세포 크기 및 성장속도에 따라 조절)

(2) Trypsinizing cells [사전준비] - Complete growth medium, pre-warmed to 37°C - Washing medium such as Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS), containing no calcium, magnesium - Dissociation reagent such as trypsin or TrypLE™ Express (Invitrogen) [실험방법] Remove and discard the spent cell culture media from the culture vessel. Wash cells using a balanced salt solution without calcium and magnesium. Gently add wash solution to the side of the vessel opposite the attached cell layer to avoid disturbing the cell layer, and rock the vessel back and forth several times. Remove and discard the wash solution from the culture vessel Add the pre-warmed dissociation reagent such as trypsin or TrypLE™ to the side of the flask; use enough reagent to cover the cell layer (approximately 1mL per 10 cm2). Gently rock the container to get complete coverage of the cell layer. Incubate the culture vessel at 37℃ for approximately 2 minutes. Observe the cells under the microscope for detachment. If cells are less than 90% detached, increase the incubation time a few more minutes. You may also tap the vessel to expedite cell detachment. Add the equivalent of 5-10 volumes of pre-warmed complete growth medium. Disperse the medium by pipetting over the cell layer surface several times. Transfer the cells to a 15-mL conical tube and centrifuge then at 200 × g for 5 to 10 minutes. Resuspend the cell pellet in a minimal volume of pre-warmed complete growth medium and remove a sample for counting. Determine the total number of cells and percent viability using a hemacytometer, cell counter and Trypan Blue exclusion. Dilute cell suspension to the seeding density recommended for the cell line, and pipet the appropriate volume into new cell culture vessels, and return the cells to the incubator.

세포의 동결보존 세포 배양시 보통 10000:1의 비율로 돌연변이체가 생기며 장기간에 걸쳐 계대 배양을 계속하게 되면 본래의 세포 집단과는 전혀 다른 세포 집단으로 변질 유전적 변이를 최소화하고 노화와 형질전환 등을 방지하기 위하여 동결 보존 필요 세포의 동결 보존시 세포에 내동성을 부여하기 위해서 dimethyl sulfoxide (DMSO) 또는 glycerol을 첨가하는데, glycerol 보다 DMSO가 더 효과가 있는 것으로 알려짐. Freezing medium에 포함된 DMSO는 세포에 독성을 나타낼 수 있으므로 동결 조작은 신속하게 진행해야 함. 동결 보존할 세포는 보존 전에 오염 여부를 확인하여야 하고 대수 증식기(log phase)에 있는 활성적인 세포를 이용 동결 시 감온 속도는 세포에 따라 다르며 보통 -1°C/min 속도로 동결 Programmed cooler를 이용하거나 또는 솜을 채운 ice box에 저장할 세포가 포함된 vial을 넣고 -70 ~ -90°C의 deep-freezer에 정치한 후 액체 질소로 옮김으로써 동결 보존 완료 Note: DMSO는 매우 toxic 물질이지만 강력한 anti-freezing activity를 가짐. bacteria에 비해 tissue cell은 크기가 크고 약하며, DMSO는 쉽게 세포 안으로 흡수되어 세포 손상을 줄 수 있는 날카로운 얼음 결정 생성을 억제하는데 비해 glycerol은 세포 안으로 흡수되지 못합. Mammalian cell은 크기가 작을수록 freezing후 생존률이 더 높기 때문에 결국 anti-freezer의 침투율과 비례 Nalgene Mr. Frosty Cryo 1℃ Freezing Containers

(3) Freezing cells [사전준비] - Complete growth medium, pre-warmed to 37°C - Washing medium such as Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS), containing no calcium, magnesium - Dissociation reagent such as trypsin or TrypLE™ Express (Invitrogen) - Cryoprotective agent such as DMSO (use a bottle set aside for cell culture; open only in a laminar flow hood) or a freezing medium such as CellBanker (Zenoaq) - Sterile cryogenic storage vials - Controlled rate freezing apparatus or isopropanol chamber - Liquid nitrogen storage container [실험방법] Prepare freezing medium and store at 2° to 8°C until use. For adherent cells, gently detach cells from the tissue culture vessel following the procedure used during the subculture. Resuspend the cells in complete medium required for that cell type. Determine the total number of cells and percent viability using a hemacytometer, cell counter and Trypan Blue exclusion. According to the desired viable cell density, calculate the required volume of freezing medium. Centrifuge the cell suspension at approximately 100–200 × g for 5 to 10 minutes. Aseptically decant supernatant without disturbing the cell pellet. Resuspend the cell pellet in cold freezing medium at the recommended viable cell density for the specific cell type. Dispense aliquots of the cell suspension into cryogenic storage vials. As you aliquot them, frequently and gently mix the cells to maintain a homogeneous cell suspension. Freeze the cells in a controlled rate freezing apparatus, decreasing the temperature approximately 1°C per minute. Alternatively, place the cryovials containing the cells in an isopropanol chamber and store them at –80°C overnight. Transfer frozen cells to liquid nitrogen, and store them in the gas phase above the liquid nitrogen.

Number of cells × 104 = cells/mL 6. Cell Counting ① ② ③ ④ Neubauer comercial chamber Pile of glass covers, and box Clean the chamber and cover slip with alcohol. Dry and fix the coverslip in position. Harvest the cells. Add 10 μL of the cells to the hemacytometer. Do not overfill. Place the chamber in the inverted microscope under a 10X objective. Count the total number of cells in 4 of the 9 major squares. Number of cells × 104 = cells/mL *Number of cells = (①+②+③+④) / 4

Number of viable cells × 104 × 2 = cells/mL Trypan Blue Exclusion - Trypan blue 입자는 세포막을 확산의 방법으로 통과하여 세포 내부로 유입되는데 생세포는 ATP 에너지를 이용한 exocytosis로 trypan blue 입자를 다시 세포 외부로 배제하게 되나, 에너지를 발생할 수 없는 사세포는 exocytosis를 할 수 없어 청색으로 염색된다. Determine the cell density of your cell line suspension using a hemacytometer. Prepare a 0.4% solution of trypan blue in buffered isotonic salt solution, pH 7.2 to 7.3 (i.e., phosphate-buffered saline). Add 0.1 mL of trypan blue stock solution to 0.1 mL of cells. Load a hemacytometer Number of viable cells × 104 × 2 = cells/mL