RNA analysis
RNA isolation from liver tissue 특정 조직 또는 세포를 용해시킨 후 RNA를 추출해 본다. Total RNA가 깨끗하게 분리 되었는지 확인하기 위하여 agarose gel에 전기영동하여 결과물을 확인한다. 이후에 유전자 발현을 측정하기 위해서는 추출한 RNA를 cDNA로 합성 한 후 quantitative-PCR을 수행하여 발현을 확인한다. Total RNA 중 mRNA는 약 1%에 해당되고, 관심 있는 특정 mRNA는 그 중에서도 극히 일부이다. 그러므로 이 mRNA를 증폭해서 눈으로 확인하기 위해 RT-PCR을 수행한다.
RNA isolation cDNA synthesis (RT-PCR) Quantitative PCR (qRT-PCR)
Introduction RNA analysis Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 유전자 발현을 보고자 할 때, DNA는 exon과 intron이 있으므로 이를 template로 쓰지 않고, mRNA를 template로 사용하여 exon만 증폭시킨다. mRNA를 이용하면 각 조직마다의 expression 정도를 보는 데에 용이하다. PCR에 쓰이는 Taq DNA polymerase는 DNA를 template로 해서 DNA를 증폭하는 효소이므로 RNA로부터 직접 증폭할 수 없다. 따라서 RNA를 template로 하는 경우에는 일단 DNA로 복사한 다음 증폭한다. 그래서 RNA를 PCR하는 방법을 RT-PCR이라고 한다. 이 때에는 RNA로부터 DNA로 합성해 주는 효소인 reverse transcriptase를 처리한다.
Introduction RNA analysis Quantitative RT-PCR Real time PCR에는 특정 파장의 빛 에너지를 흡수하였다가 고유 파장으로 빛을 발산하는 형광 물질을 사용한다. (Fluorescents Dye) Intercalator type : SYBR green, Eva Green 등 Probe type Hydrolysis probe : TaqMan 등
Materials & Methods RNA isolation RNA sample, 1% agarose gel, gel documentation, cDNA synthesis kit, PCR machine, primers, PCR pre-mix, pipet, tip Gel electrophoresis 1% agarose gel을 만든다. 추출한 total RNA를 5ul씩 loading 하여 전기영동한다. Gel documentation을 이용하여 밴드를 확인한다. 28S 18S
RNase free-water (DEPC-water) Materials & Methods RNA isolation cDNA synthesis 측정한 RNA의 농도가 1ug이 되도록 계산한다. PCR tube에 들어있는 2X RT pre-mix에 RNA, 50uM Oligo(dT) , RNase free water를 넣어 pipetting 한다. (bubble이 일어나지 않도록 주의) 상온에서 5분간 incubation 한다. PCR 기계에 넣고 cDNA synthesis reaction을 수행한다. : 50 ℃, 60min (cDNA synthesis) / 95 ℃, 5min (RTase inactivation) Contents Volume RNA 1ug of total RNA ? ul Primer 50uM Oligo(dT) 1ul 2X RT Pre-mix 10ul RNase free-water (DEPC-water) (20-?) ul Total volume 20ul
Materials & Methods RNA isolation Quantitative RT-PCR Contents Volume 2X SYBR green 12.5 ul Primer-forward 0.25 ul Primer-reverse ddw 2 ul cDNA (10ng) 10 ul total 25 ul
Results REPORT Gel 전기영동하여 나온 밴드 사진 첨부하세요. RNA isolation REPORT Gel 전기영동하여 나온 밴드 사진 첨부하세요. Kit를 사용하지 않고 매뉴얼로 RNA prep 진행과정을 조사하여 작성하세요. RNA isolation-RNA analysis의 전체과정을 작성하세요.