Chromatographic Separation of Protein

Chromatography? · 혼합물의 각 성분을 분리하는 방법. · 정지상(stationary phase) : 자기자신은 움직이지 않고 흡착 또는 분배의 역할을 하는 상. · 이동상(mobile phase) : 시료를 이동시키는 용매 등의 전개제. · 물질의 분리 원리? ① 혼합물이 정지상이나 이동상에 대한 친화성이 서로 다른 점을 이용. ② 정지상에 강하게 붙잡혀 있는 성분 : 이동 속도 ↓ 정지상에 약하게 붙잡혀 있는 성분 : 이동 속도 ↑

Chromatography · 종류와 분류 기체크로마토그래피 원통관법 액체 크로마토그래피 원통관법 명칭 이동상 정지상 분리원리 기체-고체 크로마토그래피 기체-액체 크로마토그래피 기체 고체 액체 흡착 분배 액체 크로마토그래피 원통관법 흡착 크로마토그래피 (액체-고체 크로마토그래피) 분배 크로마토그래피 (액체-액체 크로마토그래피) 이온교환 크로마토그래피 젤 여과 크로마토그래피 친화력 크로마토그래피 Chromatofocusing 소수성 크로마토그래피 이온교환 분배와 여과 생체활성 등전점 소수성 얇은 막 크로마토그래피 종이 크로마토그래피

Ion exchange chromatography · 이온교환 크로마토그래피 · Charge에 의해 분리 · Charge(전하)를 띄고 있는 ion exchanger(이온교환수지)를 이용. ① cation exchange chromatography - bead : (-) charge ② anion exchage chromatography - bead : (+) charge · Elution - salt concentration ↑ ( such as NaCl) - change of pH · 많은 양의 시료 분리 가능. 분리능 ↑ ·

Ion exchange chromatography

Gel filtration chromatography · 젤 여과 크로마토그래피 · Size에 의해 분리 · Bead : insoluble, highly-hydrated polymers. ex) dextran , agarose … 망상구조를 이룸(일정 크기 이상의 분자가 내부로 들어오는 것을 제한). · Elution large mloecules → intermediate sized molecules → small molecules ( pore size보다 작은 small molecules은 bead를 통과 → 이동속도 느리다) · 분리 가능한 양이 제한. 분리능 ↓

Gel filtration chromatography

Affinity chromatography · 친화 크로마토그래피 · Affinity(친화력) 또는 물질들의 특이적인 결합을 이용. → 정지상에 공유 결합된 물질(ligand)과 시료 중의 한 성분이 특이적으로 결합함으로써 다른 물질과 분리되는 방법. ex) 항체 & 항원 , protein A & 면역글로불린 , 호르몬 & 수용체,운반단백질 · Elution - change of pH - change of ionic strengh · 우수한 분리능.

Affinity chromatography The resin Matrix Affinity Ligand

Step 1. Loading affinity column.

Affinity chromatography Step 2. Proteins sieve through matrix of affinity beads.

Affinity chromatography Step 3. Proteins interact with affinity ligand with some binding loosely and others tightly.

Affinity chromatography Step 4. Wash off proteins that do not bind.

Affinity chromatography Step 5. Wash off proteins that bind loosely.

Step 6. Elute proteins that bind tightly to ligand and collect purified protein of interest. http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/method/Affinity.html

오늘의 실험은? · 목적 pET - , Tat – GFP(green fluorescent protein)을 affinity chromatography를 이용하여 purification · Affinity chromatography - Ni & 6x His-tag의 친화력을 이용

오늘의 실험은? Resin : Ni-NTA superflow(QIAGEN) His·bind resin(Novagen) Elution : imidazole의 농도 ↑

실험 과정 Native conditions Denaturing conditions ·

Chromatographic separation of protein       * 실험 방법      1. pET-GFP transformed E.coli cell을 LB medium(+Amp)에         inoculation.      2. 37℃ shaking incubator에서 O.D.값 0.5~0.6될 때까지 키운다.      3. O.D.값이 나오면 0.1M IPTG를 넣고 30℃, overnight induction.      4. cell harvest. (4℃, 6000rpm, 10min)      5. resuspend the pellet in 1X Binding buffer.      6. sonication. (30%, 2min - 3번)      7. centrifugation(4℃, 15000rpm, 30min)      8. column에 resin packing. (실험 전에 미리해둔다)      9. column에 1X charge buffer 5ml loading.     10. column에 1X biding buffer 5ml loading.    11. column에 sample loading     12. column에 1X binding buffer 10ml loading.     13. column에 60mM washing buffer 6ml loadimg.     14. column을 막고 250mM elution buffer 10ml loading.     15. eppen.tube에 500µl씩 받는다. 16. Bradford 변화 확인.