6장 대사산물의 생산 - 6-1. 유기산발효 - 6-2. 알코올발효 - 6-3. 유기용매발효 - 6-4. 아미노산발효 - 6-5. 핵산발효 - 6-6. 항생물질 - 6-7. 생리활성물질 - 6-8. 고분자물질발효 - 6-9. 효소 4강

6-6. 항생물질 - 항생물질(antibiotics)  Waksman(1942)의 정의  미생물에 의하여 생산된 화학물질로서 다른 미생물의 발육 또는 대사를 저해하는 물질 - 두 종의 미생물을 함께 배양하였을 때, 어느 한쪽의 발육이 억제되는 현상  항생작용(antibiosis), 길항작용 (antagonism)라 한다. - 1929년 영국의 Fleming 에 의한 penicillin  P. notatum에 의해 포도상구균 등 그람양성균의 발육을 저지 - 1940년 Florey와 chain  penicillin의 결정화 성공  1941년 미국과 영국연구진에 의해 대량배양성공 (표면배양법)  1943년 통기배양법  2차 세계대전시 상처치료제로 이용 - 1944년 미국 Waksman  Streptomyces griseus  streptomycine 발견  그람음성과 결핵균치료 - 현 6000종이 발견  100여종이 산업적으로 생산

6-6. 항생물질 경제적 중요성 - 년간 10만톤 생산 - 230억 달러이상의 시장 (1996년기준) 미국에서 년간 80억달러 식품첨가제의 시장 (1억달러)

6-6. 항생물질 이용성 1) 인간, 동물, 제한된 식물의 감염증 치료, - 의료용(G+/소수 G-)/비 의료용(식물병리/동물사료용) 2) 동물의 생장촉진제/의약품 - 치료목적으로 사용되는 양보다 낮은 농도로 적용  생장촉진(PG/TC/ERY, BA, SM) - 가축치료목적 (hygromycin B, thiostretin, tylosin …) 3) 식품보존에 이용 - Pimaricine(항진균제로 식품표면), - Tylosin(B. spore 에 유효, 통조림에 적용 - Nisin(Closteria 에 유효, 통조림) - Chlortetracycline(생선, 육류, 가축의 신선도 유지) 4) 항 종양성 항생제 - Cytostatic agent 로 임상에 응용 5) 식물병리에 대한 항생제 - 저농도에서 선택적으로 적용, 온혈동물/유익곤충에 저독성 - 토양미생물로부터 쉽게 분리 6) 생화학과 분자생물학 도구로서의 항생물질 - 세포기능을 이해하기 위한 도구로 이용 - 동물세포배양시 세균과 곰팡이 오염방지에 이용

6-6. 항생물질 작용 mode에 따른 항생제의 특성

6-6. 항생물질 6-6-1. 주요 항생물질

6-6. 항생물질

6-6. 항생물질 (1) β-Lactam antibiotics: : 공통적인 β-Lactam group 1) Penicillins - 천연  Penicillium chrysogenum  Penicillin G (G+) - 분해작용  Penicillin  Penicillin amidase  6-aminopenicillanic acid로  Penicillinase에 의해  Penicilloic acid로 분해 - 반합성에 의해 생산  6-aminopenicillanic acid로 부터  다양한 N-acyl group의 변형구조  내성에 저항성부여(효소에 내성)  G- 유효(세포막투과, 세포막합성저해)  내산성이 강화 (경구투여)

6-6. 항생물질 2) Cephalosporins - Cephalosporium acremonium - 3 type(C, N, P) - G+, -에 효과, penicillin 내성균에 효력 - 7-aminocephalsporanic acid 이용 부분합성

6-6. 항생물질 (2) Aminoglycoside 항생제 - 아미노당이 다른 아미노당과 glycosidic band로 연결 - Streptomycine, Kanamycine, gentamycine, neomycine - G-, 단백질합성저해 1) Streptomycine - 1944년 미국 Waksman에 의해  Streptomyces griseus - G+, -, 결핵균 등  포도상구균, 폐렴균, 페스트균, 콜레라균, Proteus균, Salmonella 균 등 - 그 외 3종의 유도체가 발견 ▪ S. humidus  dihydrostreptomycine ▪ S. reticuli, S. griseocarneus  hydroxystreptomycine ▪ S. griseus  mannosidostreptomycine

6-6. 항생물질 2) Kanamycine  Streptomyces Kanamyceticus(A, B, C 3종)  Streptomycine 내성균에 효과, 내성포도상구균, 적리균에 대해 감수성이 높으며 비교적 독성이 낮다.

6-6. 항생물질 3) Tetracycline : 의학적으로 광범위하게 이용  1948년 Streptomyces aureofaciens (aureomycin, 7-chlorotetracycline) 이 처음발견 - G+, G-감수성이 높음  1950년 Streptomyces rimosus (tetramycin, 5-hydro tetracycline) 이 발견 - 아메바에 높은 감수성  모핵이 유사, naphthacene ring에 여러 가지 원소와 작용기가 결합  동물의 생장촉진제로 사료에 첨가, 얼음에 첨가해서 어류의 보존에 이용

6-6. 항생물질 (4) Chloramphenicol - Streptomyces venezuelae에서 생산 - 최근 전부합성  Chloromycetin  장티프스, 이질, G+, G-, rickettsia에 효과  조혈기능에 부작용 사용이 극히 제한

6-6. 항생물질 (5) Macrolide - 큰 lactone 환을 aglycone으로 한 당이나 아미노당이 붙은 배당체 - erythromycin A 가장 많이 사용  단백질합성(50S) 저해 - G+  PN, ST, TE, CHL 등의 내성균에 효과 (엘러지반응의 대체 항생물질)

6-6. 항생물질 (6) Peptide 항생물질 - Bacillus subtilis 와 방선균이 생성 - G+, -, 결핵균에 특이적으로 작용  polymyxin 독성이 적고 G-  Viomycin 결핵균에 효과적  사료첨가제로 많이 사용

6-6. 항생물질 (7) Polyene 항생물질 - Rifamycin이 대표적이고 Nocardia mediterranei 에 의해 생산 - G+, -에 특이적으로 작용하며 독성이 적음 - Rifamycin유도체중  Rifamycin SV, 그람양성균에 강하며 결핵치료제로 널리 이용 (8) 항암성 항생물질 - 암치료에 효과가 있는 항암성 항생물질을 검색 ▪ Streptomyces antibiotics  Actinomycin C와 D ▪ Streptomyces grieus  Chromomycin A3 ▪ Streptomyces caespitosus  mitomycin C - Streptomyces verticillus  bleomycin  피부암 치료

6-6. 항생물질 (9) 농약용 항생물질 - 도열병(벼) 방지제  phenyl 초산수은 ▪ Streptomyces griseochromogenes  blasticidin S ▪ Streptomyces kasuhaensis  kasugamycin이 이용

6-7 생리활성물질 - 생물의 생명활동을 유지하기 위한 생리작용의 중요한 기능 - 대상생물  미생물, 동물, 식물 - 미생물유래 물질  Vitamin, 스테로이드계 호르몬, 식물생장호르몬, dextrane, 효소저해제 등   1. Vitamin - 미세성분으로 동물의 생리기능(합성기능이 없음) - 식물, 미생물에 의해 합성 - 지용성 비타민 : 비타민 A, D, E, F, K, U - 수용성 비타민 : 비타민 B복합체, C, L, P, 비오틴, 폴산, 콜린, 이노시톨 등 - 산업미생물 : VB2, VB12, β-carotene, ergosterol 등                : Vitamin C 일부 성분을 미생물발효로 생성

6-7 생리활성물질 1) Vitamin B2(Riboflavin) - Lactoflavin, Ovoflavin, vitamin G라고도 일컬어짐 - 수용성 비타민 - FMN, FAD의 형태로 체내에 산화환원반응에 중요한 역할(수소전달자) - 에너지 방출과 ATP생성 - 열에 안정, 산에 안정 (알카리 약) - 간, 심장, 신장에 많고 소변을 통해 배설 - 생성균주 : Ashbya gissypii, Eremothecium ashbyii,                Candida 속 효모, Clostridium 속세균 - 생성효율은 낮은 편임 (1)구조와 생합성 - pteridine 고리가 벤전고리에 축합된 alloxanzine 유도체(가역적인 산화환원제) - 곁사슬에는 ribitol유도체인 C5-polyhydroxyl 기로 구성 - Ashbya gissypii, Eremothecium ashbyii로부터 유도된 합성경로      철분에 의해 저해 받지 않음

6-7 생리활성물질 (2) 배지 ① Corn steep liquor(CSL) 2.25%,    (2) 배지    ① Corn steep liquor(CSL) 2.25%,    ② peptone 3.5%, 대두유 4.5%    ③ glycine, distiller's soluble 또는 효모추출물 소량첨가 (3) 배양     : 121℃, 3시간 (살균) → 24~48시간(종모배양) → 0.75~2%(접종)     → 28℃에서 0.3 vvm 7일간배양 (4) 회수 - 사료용: pH 4.5조절 → 농축 → 드럼건조 - 의약용: pH 4.5조절 → 121℃, 1시간처리 → 추출 용출 → 원심분리 → 상층액 정제

6-7 생리활성물질 2) Vitamin B12 - 간에서 추출 → 악성빈혈제로 활용 - 작고 붉은 바늘모양, 물과 알코올에 용해 (에테르와 아세톤에 불용성) - 구조적으로 특징은 그림과 같다.    : 기본구조 corrin (tetrapyrrole) - 자연계에서 미생물에 의해 생산  동물 →사료로 공급, 장내미생물에 의해 공급 생합성 1단계: 혐기적 조건하에서 5‘-deoxyadenosylcobiamide의 형성(2~4일) 2단계: 호기성조건하에서 5,6-dimethybenzimidazole합성에 이어        5‘-deoxyadenosylcobalame(Coenzyme B12)(3~4일) - 초기에는 세포 내에 축척 되지만 과량 생산시 세포 외로 분비

6-7 생리활성물질 - 생성균주와 수율 (표 6.29) - Pseudomonas denitricans:  코발트염과 DBI가 첨가된 배지,   호기적으로 생성, 탄소원으로 사탕무우밀    - 생합성 활성화    - 세포막투과성 증가시키는 betaine(trimethyl glycine)이 함유 - Pseudomonas denitricans MB 2436(60mg/L)  Protoaminobacter와 rube/Rhodopseudomonas spheroides의 protoplast 를 융합하여 얻은 R. prtamicus 변이주를 이용 135mg/L까지 생성 - 정제   : 전 배양액/분리된 균체현탁액 80~120℃, pH 6.5~8.5 30분간 가열   : 유리된 cobalamin을 질산나트륨 존재 하에서 KCN처리 Cyanocobalamin 변화   : 80% 정제 → 사료   : 95~98% → 의약용

6-7 생리활성물질 3) β-Carotene 및 Ergosterol : 식물/미생물에 의해서만 생성 β-Carotene   → Provitamin A와 식용색소로 이용   → Carotenoid 들도 식용색소로 이용 (화합합성법으로 생산) - 생성균주 : Blakeslea trispora    (자웅이주로 함께 배양시 최대생산) Ergosterol   → 자외선 노출시 Vitamin D로 전환, provitamin D   → 미생물에서 발견   → Saccharomycess cerevisiae 등 효모균체에서 생성 (최대량 검조균체의 10%이상)

5) Vitamin C (Ascorbic acid) 6-7 생리활성물질 4) 바이오틴 : 장내세균과 Bacillus 속에서 생합성 : 현재 전량 화학합성법으로 생산 5) Vitamin C (Ascorbic acid) - 영양강화제 및 항산화제로 널리 이용 - 발효와 합성법에 의해 생산  D-sorbitol → L-sorbose (산화미생물을 이용)  수득율이 반감    Acetobacter suboxydans, Gluconobacter roseus를 이용 90%이상 수율  sorbose 발효의 주원료   → D-glucose를 Ni를 촉매로 D-sorbitol   → 30℃, 통기교반 고농도의 sorbitol 배지를 feeding   → 30시간 배양 → 수득율 95%까지 도달  고농도 배양시   → 25%까지 발효가 가능하나   → 균체 수율을 증가한 후 sorbitol을 점진적으로 증가하여 고 효율의 최종산물을 획득 - 정제   → 고형분제거 → 감압농축 → methanol 결정석출 → 분리 - Isovitamin C (D-araboascorbic acid) - 산화방지제  균주 : Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens 등  Pen. natatum → glucose로부터 직접합성(수율 45%)

6-7 생리활성물질 2. 스테로이드 호르몬 - 부신피질 호르몬인 cortisone (관절류머티스 치료제) - Rhizopus nigricans 등 곰팡이  progeateron(황체호르몬)의 11α-hydroxylprogesterone  Hydrocortisone(Corisol), Prednisone, Prednisolone, Priamcinolone 등이 실용화 - 수산화과정, 탈수소과정, 수소첨가반응, 에폭시화반응, 측쇄 및 핵의 분열 등 3. 식물생장호르몬 - Gibberellin    : 식물세포의 분열, 성장 및 종자의 발아를 촉진 - 키다리병균인 Gibberella fujikuroi     벼의 성장을 촉진하나 결실이 불량하여 사멸     생리활성물질인 지베릴린을 분리(38종이상이 보고)     호박산, 포도당, 무기염류로 배양     1g/L의 지베릴린을 분리 : 활성탄 흡착→ 아세톤용출 →초산에틸로 추출 →정제과정

6-7 생리활성물질 4. Dextran - 수혈시 혈장증량제, 냉온수에 잘 용해 - 점도를 가지고 있어 유제, 안정제로서 아이스크림, 시럽, 젤리 등에 이용 - 덱스트란의 황산에스터르→ 항혈액응고제로 사용    : Leuconostoc mesenteroides 를 이용 설탕으로부터 생성     : Acetobacter capsultatum 은 덱스트린으로부터 생성 - dextrane 생성      n(Sucrose) → (Glucose)n + n(Fructose)    : 포도당 α-1,6 결합, α-1,4 또는 α-1,3결합 비율은 균주에 따라 차이 - 대용혈장용 α-1,6결합이 많은 것이 필수, 평균분자량 75,000

6-7 생리활성물질 - 제조방법 1) 발효법  Leuconostoc mesenteroides    1) 발효법       Leuconostoc mesenteroides       설탕 10%, 효모추출액, 무기염류 등 배지       25℃, 통기교반 → pH 4.4~4.6로 저하되고 점성이 증가       정제 : 메탄올 침전 → 물에 용해 → 메탄올로 재침전 → 물로 용해           산가수분해 (Mw, 75,000) → 메탄올로 재침전 → 75,000의 분자량을 회수    2) 효소법       설탕 + dextransucrase : dextran 합성       반응조건조절에 의해 75,000의 분자량의 것을 수확       장점 : 불순물의 정제과제과정 없이 최종산물의 수확이 용이

6-7 생리활성물질 5. 효소저해제 - 효소의 기능의 저해를 통하여 생체기능의 제어에 이용  전분가수분해 저해제의 경우    - 효소의 기능의 저해를 통하여 생체기능의 제어에 이용       전분가수분해 저해제의 경우         : 비만억제/당료병 치료에 이용    - 화학합성/식물의 저해제 → 고분자물질       미생물유래 저해제 → 저분자물질(독성과 안전성이 높음)    - 효소저해물질 : 세균, 곰팡이, 방성균 등    - 단백질, 당가수분해 저해물질 등이 알려져 있다.

6-7 생리활성물질 - 단백질분해효소 저해제 티올 및 세린계열의 단백질분해효소    - 단백질분해효소 저해제      티올 및 세린계열의 단백질분해효소      : 트롬빈, thrombokinase, cathepsin, 파페인, 플라스민, 키모트립신 등      : 염증, 혈전, 출혈과 관련된 질병을 유발      : 상기 억제제는 상기 관련 질병을 치료 (Leupeptin, chymostatin, antipain, elastanal 등 )

6-7 생리활성물질 - Glucosidase 억제 : amylase, saccharase 와 같은 glycosidase 억제제         당료병치료제      : 열에 강하고 비단백질성으로 단백질분해효소에 의해 분해되지 않는다      : 분자량이 큰 물질 → α-amylase 저해        분자량이 작은 물질 → saccharase (sucrase/maltase 저해작용)    - α-Glucan 합성 억제      : 충치예방 목적으로 저해제의 연구가 진행       : 충치균인 Streptococcus mutans는 glucan을 합성하여 이에 부착 치태를 만듬       : Aspergillus terreus → mutastein은 당단백질의 성질    - 지질합성관련 저해효소      : 지질합성관련 효소는 비만, 과콜레스테롤증 또는 염증을 유발      : monacolin K, compactin, mevinilin 등

6-7 생리활성물질 6. 진균독소 - 인간과 동물에 독성 - 열에 안정하고 분자량이 작은 물질 - 금속 유가공에서 독성을 유발    - 인간과 동물에 독성    - 열에 안정하고 분자량이 작은 물질    - 금속 유가공에서 독성을 유발      예) aflatoxin ←Aspergillus 유래          : 간의 심한 손상 (DNA에 결합하여 RNA 합성을 억제)     예) Cephalosporium 과민성폐렴을 유발     예) Aspergillus, penicillum 등도 과민성폐렴을 유발           - 발견균주에 따른 분류      1) 식중독 유래 진균독소         : 사람이나 가축의 식중독 원인 음식물에서 분리         : 아플라톡신, fusarium 독소, patulin, maltotryzine, sporidesin 등      2) 오염균주 유래 진균독소         : 식품이나 사료중에 오염된 곰팡이를 분리하여 실험동물에 독성확인         : 황변미독(fumonisin)        3) 보존균주 유래 진균독소         : 식품과 직접적인 관계는 없고 1)과2)보다 독성이 떨어지는 독소    - Aspergillus, penicillum속 곰팡이는 곡류, 두류, 옥수수, 땅콩 등에 번식 (100여종이 발견)