식육내 항생·항균제 간이검사법 EEC 4-plate 법

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1 식육내 항생·항균제 간이검사법 EEC 4-plate 법
미생물균주: B. subtilis BGA, M. luteus ATCC 9341 (Kocuria rhizophila ATCC 9341) 배지: Test Agar(Merck사) , pH 6.0, 7.2, 8.0, 8.0 * pH 7.2 plate : 0.1㎍ TMP/㎖ agar 시험용평판: 4개의 멸균배지에 각각의 균액 1ml 첨가 → petri-dish에 6ml씩 분주 시험조작 - 디스크법: 식육 절개 → 10mm Disc 넣어 분간 육즙 흡수 → 시험용평판 위에 고착 → 배양 - 직접법: 무균적으로 사방 1cm 두께 2mm 절단 → 시험용평판 위에 고착 → 배양 배양조건: 32℃, 16시간 결과판정: 발육억제대 직경 14㎜이상

2 EEC 4-plate 법 (시험결과)

3 EEC 4-plate법 (결과판정)

4 EEC 4-plate법에 의한 계열별 억제유형

5 식육내 항생·항균제 간이검사법 E. coli plate 법 미생물균주: E. coli ATCC 11303
배지: Test Agar(Merck사) pH 6.0 시험용평판: 멸균배지에 시험균액(Nutrient broth에 17±1시간 배양액) 0.5ml 첨가 → petri-dish에 8ml 분주 시험조작 - 디스크법: 식육 절개 → 10mm Disc 넣어 분간 육즙 흡수 → 시험용평판 위에 고착 → 배양 - 직접법: 무균적으로 사방 1cm 두께 2mm 절단 → 시험용평판 위에 고착 → 배양 배양조건: 32℃, 16시간 결과판정: 발육억제대 직경 12㎜이상

6 식육내 항생·항균제 간이검사법 식품공전법 미생물균주:
B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC , B. megaterium ATCC 9885, B. stearothermophilus ATCC 1049, E. coli ATCC 11303, Kocuria rhizophila ATCC 9341 배지: Antibiotic medium #5(AM#5, pH 7.9), AM #8(pH 5.9), Mueller Hinton medium(MH, pH 7.3), AM#2(pH 6.6), Test agar (TA, pH 6.0), EEC agar (EEC, pH 8.0) 시험용평판: Bs/AM#5, Bc/AM#8, Bm/MH(0.15㎍ TMP/㎖ agar), Bst/AM#2, Ec/TA, Kr/EEC 시험조작: 직접법 → 짜내기법 (착즙기 이용 육즙 디스크에 흡수), 추출법 → 디스크 삽입법 * 추출법 삭제로 인해 축산물가공품 등의 간이검사 애로 발생 예상

7 식육내 항생·항균제 간이검사법 식품공전법 시험균 배양 디스크 삽입법 결과판정: 발육억제대 직경 12㎜이상 양성 판정
- 우유 : 충분히 혼합 후 82 ℃ 2.5분간 가열 후 냉각 , 분유류 14% 수용액으로 조제 - 식용란 : 난백과 난황 교반 - 식육 : 근육 절개 ⇒ 디스크 6개 삽입 30-60분간 체액을 흡수 시험균 배양 - Bs/EC 37℃, Bc/Kr 30℃, Bm 45℃, Bst 55℃ 17±1시간 결과판정: 발육억제대 직경 12㎜이상 양성 판정

8 식품공전 간이검사법에 의한 계열별 억제유형 B. m (MH) B. st (AM #2) B. s (AM #5) B. c
K. r (EEC) E.c (TA) 추정 물질 계통 ++ + Tetracycline계 － Macrolide계 +++ Penicillin계 Aminoglycoside계 Sulfonamide계 Quinolone계 Cephalosporin계 Peptide계 Polyether계 Novobiocin  +++: 0.1 ppm 이하, ++: 0.1∼1 ppm, +: 1∼10 ppm, -: >10 ppm

9 간이검사킷트 종류 및 특성 구 분 Premi Test KIS Test ROSA Enroflox Parallux
원 리 미생물학적 방법(MB) 면역화학적 방법(IC) 시 료 닭 근육(육즙) 등 닭 신장 등 닭 근육 등 주요 검출대상 설파제, 테트라싸이클린계 등 퀴놀론계 중 엔로/시프로 플록사신 퀴놀론계, 설파제, 테트라싸이클린계 등 부대장비  간이 Incubator Starter Kit (70만원) 20 test용 (150만원) 4 test용 (90만원) Parallux system (1,650만원) Multi-extractor (500만원) 검사시간 약 3시간 8분 10분 시료당 가격 (추산가) 7,000원 4,000원 10,000원 2,500원 (퀴놀론계) Parallux 킷트 : 퀴놀론계, 설파제, 테트라싸이클린계, 베타락탐계 동시검사시 (시료당 10,000원 추산)

10 국내산 식육의 잔류물질 검사체계 개선 미생물학적 간이검사킷트 구 분 FAST BmDA KIS Premi STOP 시험균 Bma
B.stb Bsc 시험방법 시료 절개, 면봉으로 체액 흡수 시료 절개, 디스크로 체액 흡수 시료절개․압착후 육즙 80℃, 10분간 열처리 배양온도(℃) 45 64 30 검사시간 6-24시간 4-6시간 2.75-3시간 약 3시간 16-24시간 제조사 Editek/ USA MeDexx/ Korea Charm Sci./USA DSM/ NL Environ Diag./                                                                                                                                                   aBm: Bacillus megaterium, b B.st: Bacillus stearothermophilus, cBs: Bacillus subtilis.  FAST: Fast antimicrobial screen test, BmDA: B. megaterium disc assay, KIS: Kidney inhibition swab test, Premi: Premiⓡ test for the detection of antibiotic residues in kidney, STOP: Swab test on premises.

11 미생물학적 간이검사킷트별 검출한계 ( ng/ml, g)
Substances FAST BmDA KIS Premi STOP MRL Tetracyclines CTC OTC TC 200 800 400 500 1,000 6,000 2,000 100 50 6,200 3,100 1,600 250 Sulfonamides SMT SDM SQX ㅡ 75~100 25~50 75 β-lactams Penicillin Ampicillin Amoxicillin 6 2.5 5 1600 10 Quinolones Enrofloxacin Danofloxacin 10,000 >600 Macrolides Tylosin Erythromycin ※ 각 제조사에서 제시한 검출한계임

12 퀴놀론계 검출용 면역학적 간이검사킷트 구 분 Parallux ROSA ® ERFX EIA 검사원리 형광면역법 IC ELISA
퀴놀론계 검출용 면역학적 간이검사킷트 구 분 Parallux ROSA ® ERFX EIA 검사원리 형광면역법 IC ELISA 검사시료 닭근육 등 식육 등 시료전처리 육즙·희석 추출·희석 검사시간 10분 8분 1.25시간 검출감도 (식육) ppb 10-20 ppb 10 ppb 검출물질 엔로플록사신 등 14종이상 엔로/시프로 플록사신 제조사 주)MEDEXX 한국 Charm Sci., USA Food Diagn., * ROSA : Rapid One Step Assay, IC(Immunochromatography), ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

13 Premi Test

14 How to use Premi®Test? (1)
Step 2: 식육 샘플을 2 cm3 정도 취해 프레스기에 넣고 육즙 추출 Step 1: 필요한 수만큼 앰플 절단 멀티 프레스기를 이용하면 샘플 12개의 육즙을 한번에 추출 가능

15 How to use Premi®Test? (2)
Step 3: 육즙 100μl를 취해 앰플의 배지 위에 천천히 떨어뜨린다 Step 4: 육즙이 흡수될 수 있도록 실온에서 20분간 방치 Step 5: 증류수를 이용하여 조심스럽게 배지 내 육즙을 두 번 세척

16 How to use Premi®Test? (3)
Step 6: 플라스틱 호일로 앰플의 뚜껑을 닫는다 Step 7: 배양기의 온도(64°C)를 확인한 후 앰플을 넣고 배양 Step 8: 3시간 동안 배양한 후 앰플을 꺼내어 색상 변화 관찰

17 Premi Test □ 제조사가 제시하는 닭 근육 중 Premi 킷트의 항생제 검출능 Antibiotics 검출감도 (ppm)
MRL* (ppm)  Tetacyclines CTC/OTC/TC 3종 합으로서 0.2 ppm β-lactams  Chlortetracycline 0.1  Penicillin G 0.0025 0.05  Oxytetracycline  Ampicillin 0.005 -  Tetracycline  Amoxicillin Sulfonamides Macrolides  Sulfamethazine 총설파제 0.1 ppm  Tylosin 0.025 0.2  Sulfadimethoxine  Erythromycin 0.05～0.075 0.125  Sulfaquinoxaline *Korean MRL in chicken muscle or chicken meat. ☞ 제조회사: DSM, The Netherlands

18 KIS, Kidney Swab Test The KIS Test has been successfully applied to beef and pork kidney. In October 2008, the USDA Food Safety and Inspection Service (FSIS) awarded Charm Sciences a contract to provide Charm KIS Tests to USDA inspectors at slaughter facilities to screen for sulfonamides and antibiotic drugs under the National Residue Program (NRP).

19 KIS, Kidney Swab Test □ 제조사가 제시하는 식육 중 KIS 킷트의 항생제 검출능 Antibiotics
검출감도 (ppm) MRL* (ppm)  MRL Tetacyclines CTC/OTC/TC 합으로 1.2 β-lactams  Oxytertracycline 2.0  Penicillin G 0.05 Sulfonamides 총설파제 0.1 Macrolides  Sulfamethazine 0.2  Tylosin  Sulfadimethoxine * Korean MRL in chicken kidney or chicken meat. 제조회사 : Charm Science Inc, USA (

20 ROSA, Rapid One Step Assay
The Charm Enroflox Test is a rapid, user-friendly test for enrofloxacin detection with high sensitivity in raw or pasteurized milk, or tissue. The Charm Enroflox Test is a member of the ROSA® (Rapid One Step Assay) family of tests, utilizing the same equipment as other ROSA tests.

21 ROSA, Rapid One Step Assay

22 양성율(Percent Positive)
ROSA, Rapid One Step Assay □ 제조사가 제시하는 닭고기 중 ROSA Enroflox의 검출능 농도 (ppm) 양성율(Percent Positive) MRL (ppm) 0%  닭 근육 : Enrofloxacin과  Ciprofloxacin의 합으로서  0.1 ppm 0.005 0.01 70% 0.02 100% 0.03 * 제조회사 : Charm Science Inc, USA (

23 Parallux Kit Parallux combination kit
 1.  Penicillin G, Ampicillin, Amoxicillin, Cloxacillin, Dicloxacillin, Ticarcillin  2. Tetracycline, Oxytetracycline, Chlortetracycline, Doxycycline  3. Sulfa drugs  4. Norfloxacin, Enrofloxacin, Danofloxacin, Oxolinic acid, Ciprofloxacin, Flumequine, Nalidixic acid, Ofloxacin, Lomefloxacin, Sparfloxacin, Enoxacin, Orbifloxacin, Pefloxacin, Levofloxacin

24 Parallux Kit □ 제조사가 제시하는 식육용 Parallux Quinolones Kit의 검출능 Antibiotic
첨가농도 (ppm) 양성율 (% Positive, n=30) MRL (ppm) Enrofloxacin 0.04 100%  닭 근육 : Enrofloxacin과  Ciprofloxacin의 합으로서  0.1 ppm Norfloxacin Danofloxacin Ciprofloxacin Lomefloxacin Enoxacin Orbifloxacin Ofloxacin 0.07 Nalidixic acid Sparfloxacin 0.085 Oxolinic acid 0.1 Levofloxacin Flumequine Pefloxacin *제조회사 : ㈜ 메덱스 MEDEXX (

25 □ 제조사가 제시하는 식육용 Parallux Combination Kit의 검출능
Antibiotic 첨가농도 (ppm) 양성율 (% Positive, n=30) MRL Penicillins   Penicillin G 0.02 100 0.05  Amoxicillin -  Ampicillin  Cloxacillin 0.06  Dicloxacillin 0.1 Tetracyclines Chloretracycline 0.125 CTC/OTC/TC 합으로 0.2 (닭 근육)  Oxytetracycline  Tetracycline  Doxycycline  Methecycline  Demeclocycline 0.15

26 □ 제조사가 제시하는 식육용 Parallux Combination Kit의 검출능 (계속)
Antibiotic 첨가농도 (ppm) 양성율 (% Positive, n=30) MRL Sulfa drugs  Sulfathiazole 0.1 100 총설파제 0.1ppm  Sulfachlorpyridazine 0.05  Sulfamethoxypyridazine  Sulfamethoxazole  Sulfamonomethoxine  Sulfachlorpyrazine  Sulfadimethoxine  Sulfadiazine  Sulfamerazine  Sulfamethazine  Sulfaquinoxaline  Sulfadoxine  Sulfaphenazole  Sulfisoxazole

27 Microbial Receptor Assay (미생물수용체법)
Charm II assay : Charm Science Inc., USA TAB(Test for AntiBiotics) : 인투젠(IN2GEN), 한국

28 Microbial Receptor Assay (미생물수용체법)
검사원리 - 미생물수용체 또는 항체(binding reagent)에 시료(항균물질) 와 방사성동위원소(C14 또는 H3) 표지 항균물질(tracer)의 순차적 또는 경쟁적 반응 - 원심분리 후 수용체에 결합된 tracer의 량을 scintillation counter로 측정 - 미리 설정한 control point 값을 기준으로 잔류여부 판정 · 양성추정(suspect): ≤CP 값 (시료내 항균물질 잔류추정)

29 Charm II & TAB Receptor Assay (미생물수용체법)
대상시료 - 뇨, 혈청, 근육, 간 , 신장 , 우유, 계란 등 검사물질군(계열) - 항생물질: β-lactams, tetracyclines, macrolides, streptomycins, amphenicols 등 - 합성항균제: Sulfa drugs

30 Charm II & TAB Receptor Assay (식육내 설파제 계열검사)
Sulfonamide sequential assay(tissue) - 시료전처리: 식육 10 g에 MSU buffer 30㎖를 가하여 균질화하여 80℃ 45분간 가열, 냉각, 원심분리후 상층액을 시험용액으로 사용 - 검사방법 White 시약 → DW 300㎕, 10초간 혼합 → 시료추출액 혹은 positive control 2㎖→ 10초간 혼합 → 35℃, 2분간 → Pink 시약, 10초간 혼합 → 35℃, 2분간 → 3분간 원침 → 즉시 상층액 제거 → DW 300㎕, 10초간 혼합 → scintillation fluid 3㎖ → 마개를 씌우고 10초간 혼합 → 3H 측정 - 결과판정(Suspect): ≤ control point(cpm) · 양성추정시료 HPLC 등에 의해 개별물질 확인 정량

31 Charm II Receptor Assay (scintillation counter)

32 IV. 축산물 중 항생·항균제 간이검사법 2. 우유 분임토의 주제선정 배경

33 유중 항생·항균제 간이검사 TTC-II법 검사원리: 시험균 증식시 생성되는 succinate dihydrogenase
에 의해 무색 TTC → 도홍색의 triphenylformazan 으로 환원 여부 확인(설파제 감도 향상 TMP 첨가) 미생물균주: Strep. thermophilus ATCC 14485 배지: 10% Skim milk 시험조작: 원유 시료, 음성대조, TMP 대조 시료 각각 8ml → 50㎍/ml TMP용액 1ml 첨가(음성대조 제외)→ 82℃, 2.5분 가열 → 균배양희석액(1:1, v/v) 1ml→ 37℃, 2시간 배양→ 4% TTC 300㎕ 첨가→ 37℃, 1시간 반응후 결과 판정 결과판정: TMP 대조 시료 색상에 비해 현저히 옅을 경우 양성 판정

34 유 중 항생·항균제 간이검사 식품공전법 -개정전 미생물균주:
B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC , B. megaterium ATCC 9885, B. stearothermophilus ATCC 1049 배지: Antibiotic medium #5(AM#5, pH 7.9), AM #8(pH 5.9), Mueller Hinton medium(MH, pH 7.3), AM#2(pH 6.6) * MH pH 7.3 plate : 0.15㎍ TMP/㎖ agar 시험조작: 우유시료 82℃, 2.5분간 가열 → 10mm Disc에 시료 흡수 → 시험용평판위에 고착 → 배양( Bs /Bc 30℃, Bm 45℃, Bst 55℃ , 17±1시간) 결과판정: 디스크 주변 억제대 직경 12㎜이상

35 유중 항생·항균제 간이검사 Parallux법 검사원리: 형광면역법 검사가능 물질
- Penicillins, Ceftiofur 등 베타-락탐계 - Sulfamethazine, Sulfathiazole 등 설파제 - Oxytetracycline 등 테트라싸이클린계 - Enrofloxacin 등 퀴놀론계

36 유 중 항생·항균제 간이검사법 Charm II & TAB assay 검사원리: 방사성동위원소면역법 검사가능 물질
- Penicillins, Ceftiofur 등 베타-락탐계 - Oxytetracycline 등 테트라싸이클린계 - Sulfamethazine 설파제 - Spiramycin 등 마크로라이드계 - Neomycin 등 아미노글리코사이드계 - Spectinomycin - Chloramphenicol 등

37 원유 내 세파계 항생제 검출시험 결과 (Ceftiofur & Ceftriaxone )
간이검사법 (TTC-II) Ceftiofur: ppm Ceftriaxone: ppm

38 원유 내 세파계 항생제검출시험 결과 (Ceftiofur & Ceftriaxone )
간이검사법 (Delvo test) Ceftiofur: ppm Ceftriaxone: ppm

39 원유 내 세파계 항생제 검출시험 결과 (Ceftiofur & Ceftriaxone)
간이검사법 (Eclipse 50) Ceftiofur: ppm Ceftriaxone: ppm

40 원유 내 세파계 항생제 검출시험 결과 (Ceftiofur & Ceftriaxone , 2006. 12)
(양성건수/반복횟수) Spiked (ppm)  TTC-II Delvo test Eclipse kit Parallux kit Charm II Remark CTA CTF 0.01 0/3 0/4 1/3 2/2 0.025 3/3 0.05 NT 0.1 4/4 MRL 0.25 0.5 1.0 MDL50  ≤0.01 CTA ; Ceftriaxone, CTF ; Ceftiofur, NT ; Not tested. Parallux kit의 경우 Ceftiofur channel에서 ceftriaxone 검출

41 IV. 축산물 중 항생·항균제 간이검사법 3. 식용란 분임토의 주제선정 배경

42 식용란의 항생제 간이검사법 식품공전 – 개정전
미생물균주: B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC , B. megaterium ATCC 9885, B. stearothermophilus ATCC 1049 배지: Antibiotic medium #5(AM#5, pH 7.9), AM #8(pH 5.9), Mueller Hinton medium*(MH, pH 7.3), AM#2(pH 6.6) * MH pH 7.3 plate : 0.15㎍ TMP/㎖ agar 시료준비: 시료 5개 혼합 전란액 시험조작: 전란액 10g → 구연산･아세톤 완충액 10ml 첨가 추출 → 85℃,15분간 가열･냉각→ Disc(10mm) 침지→ 시험용평판위 고착 → 배양(Bs /Bc 30℃, Bm 45℃, Bst 55℃, 17±1시간) 결과판정: 디스크 주변 억제대 직경 12㎜이상 분임토의 주제선정 배경

43 식용란의 항생제 간이검사법 디스크법(4-plate법, 분석법 편람)
미생물균주: E. coli ATCC , B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 11778, B. megaterium ATCC 9885 균주와 조합 배지: Test agar pH 6.0 *Bs/AM #5(pH 7.9), Bc/AM #8(pH 5.9), Bm/Mueller Hinton medium(pH 7.3) 시료준비: 시료 5개 혼합 전란액 시험조작: 전란액 10g → 구연산･아세톤 완충액 10ml 첨가 추출 → 85℃,15분간 가열･냉각→ Disc(10mm) 침지→ 시험용평판위 고착 → 배양(Ec/Bs /Bc 30℃, Bm 45℃ 17±1시간) 결과판정: 디스크 주변 억제대 직경 12㎜이상 분임토의 주제선정 배경

44 Charm II Receptor Assay (계란내 설파제 계열검사)
Sulfonamide sequential assay(tissue) - 시료전처리: 전란액 10 g 끓는물에 6분간 가열, MSU buffer 30㎖를 가하여 균질화 (30초), 원심분리 후 상층액을 시험용액으로 사용 - 검사방법 White 시약 → DW 300㎕, 10초간 혼합 → 시료추출액 혹은 positive control 2㎖→ 10초간 혼합 → 35℃, 2분간 → Pink 시약, 10초간 혼합 → 35℃, 2분간 → 3분간 원침 → 즉시 상층액 제거 → DW 300㎕, 10초간 혼합 → scintillation fluid 3㎖ → 마개를 씌우고 10초간 혼합 → 3H 측정 - 결과판정(Suspect): ≤ control point(cpm) · 양성추정시료 HPLC 등에 의해 개별물질 확인 정량