HCV Ag 검출을 위한 Trak-C® 검사의 임상적 유효성 검토 면역혈청계 임성희

Hepatitis C Hepatitis C Virus (HCV) 감염에 의해서 유발되는 급, 만성질환. 85% 정도가 만성화됨. → 간경변증과 간세포암을 높은 빈도로 유발. 전세계 인구의 1~3%가 감염. 세계인구의 약 3.1%, 국내 70만명 정도. (1999년 WHO보고서) 일반적인 간염 증세가 없어 건강검진이나 수술전 검사시에 우연히 발견되는 경우가 많음. 연령이 높을수록 증가 (일반적인 다른 간염에서는 피로감이나 황달 같은 증세가 나타남.) 남자의 발생 비율이 여자에 비해 2~4배 가량 더 높다. 당뇨병 환자에서 C형 간염 바이러스 감염율 약 3%.

HCV. Envelope Proteins E1 & E2 Core Protein (cAg) ssRNA HCV Structure Envelope Proteins E1 & E2 Core Protein (cAg) ssRNA Flaviviridae virus

HCV.. Organization of the HCV genome and encoded proteins (3000 아미노산) 5’ 3’ C E1 E2 /NS1 NS2 NS4 NS5a NS5b NS3 a b Protein size KDa gp 32-35 gp 68-72 9500 nucleotides 17-22 23 70-72 8-10 27 56-58 68-70 Protein function Core Envelope Non Structural C22 HCV 3.0 peptides NS5 Viral replicase C200 C100 and C33 peptides

HCV 검진의 필요성 C형 간염은 50대부터 발생빈도가 높아지므로 고연령의 경우에서 검사의 필요성 증대 서서히 진행되는 간염으로 알려져 있어 급성 전격성 간염으로 진행되는 경우는 드물고 약 80%가 만성간염으로 진행. 이중 20%~25%가 장기간에 걸쳐서 간경변증이 될 가능성 큼. 특히 B형 간염환자가 C형 간염을 동반한 경우 간경변증과 간암으로 발병할 가능성 매우 높다. C형 간염의 예방백신은 아직 개발되지 않음.

HCV 항체검사의 문제점 . 위양성 문제: 자가면역성 간염에서 20%~80%가 양성으로 나타남. 위양성 문제: 자가면역성 간염에서 20%~80%가 양성으로 나타남. 위음성 문제: 임상적으로 C형간염으로 생각되는 증례에서 HCV 항체가 음성이면서도 바이러스의 유전자가 직접 검출 되는 경우가 있음 → 바이러스에 감염된 경우임에도 항체생산이 안 되는 면역억제 상태. 바이러스의 유전자변이를 일으켜 특이항체를 생성하지 않는 경우, 항체생성 이전의 window 단계. 급성기에는 검출되지 않음: 급성 감염 후 3~6개월 이후라야 HCV항체가 양성으로 나타남. HCV항체 양성의 경우에도 C형 간염 바이러스에 감염되었음을 의미하기는 하지만, 감염이 지속되고 있는 것인지 혹은 이미 바이러스는 배제되고 항체만 양성으로 나타나는 것인지 감별이 안됨.

HCV course of infection Earlier Detection “Screening” Anti-HCV “Free HCV Ag” “Free” Ag “Total” (Antibody Bound) “Total” Ag Days Years Time

Hepatitis C 진단검사 방법 HCV Antibody RIBA (other western blot) Serologic response to HCV RIBA (other western blot) Confirmation of Antibody RNA Quantitative and Qualitative Viral load Genotyping test Identification of viral genotype

+/+ + /- - /+ - /- Infected with viraemia Window Period (acute) Inmunocompromised Resolved Infection or no replication period No Infection by HCV + Anti-HCV HCV Antigen Treatment decision Follow up

현재 우리나라의 HCV 진단검사 1. Anti-HCV - Anti-HCV ELISA - Anti-HCV RIBA 2. HCV RNA - HCV RNA 정성검사 - HCV RNA 정량검사 3. 아직 항원 검사가 사용되지 못함

Materials -> 총 300개 혈청 검체 확인된 C형간염 환자 50명의 양성검체 50개 (연세의료원 소화기내과 환자군) 치료시작 전부터 연속적으로 채취한 치료환자 15명의 연속검체 50개 혈청 건강증진센터를 방문하여 확인된 200명의 건강대조군 검체 200개 등 -> 총 300개 혈청 검체

방 법 1. HCV 항체 검사 녹십자 시약(Genedia Anti-HCV 3.0 ELISA)을 이용 방 법 1. HCV 항체 검사 녹십자 시약(Genedia Anti-HCV 3.0 ELISA)을 이용 제조사의 지침에 따라 검출. 2. HCV RNA 정량적 역전사중합효소 연쇄반응 Roche 의 Amplicor Monitor HCV v.2.0 kit 를 이용 RNA를 분리 GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer, USA) PCR후 제조사의 지침대로 검출.

(Ortho clinical Diagnostics, USA) 3.Ortho HCV Trak-C 검사 (Ortho clinical Diagnostics, USA) HCV항원을 검출하기 위해, 항체의 해리과정 후 핵막중심항원에 대한 항체를 이용하여 효소면역법으로 검출. : 100μL검체 + 50μL의 전처리시약과 혼합 → 56 ℃ , 30분간 반응시켜 항원항체 복합체를 분리하고 이 중 100μL를 취하여 단클론항체가 부착된 microplate well 에 넣어 반응시킴. 다시 conjugate를 반응시킨 후 세척, 발색시켜서 흡광도를 측정. 1.5 pg/ mL 이상을 양성으로 판정. ℃ Step 1 Sample dispensed into well 60 min incubation with shaking Wash Step 2 Conjugate added 30 min incubation OPD substrate addition Stop Read OD cAg Pretreatment 56 ℃ 30 min Pretreated Sample Sample

결 과 . PCR 양성 결과인 환자군 50명의 검체 Anti-HCV 음성인 건강 대조군 200명의 검체 결 과 . PCR 양성 결과인 환자군 50명의 검체 Table 1. Trak-C HCV Ag 결과와 HCV PCR결과 HCV PCR Positive Trak-C Positive 46 Negative 4 Anti-HCV 음성인 건강 대조군 200명의 검체 : HCV항체 음성인 건강대조군(n=200)은 Trak-C HCV 검사법으로 HCV항원이 모두 음성.

Fig. 1. HCV Ag 정량검사와 HCV RNA 정량 결과

Table 2. 치료 전후 환자군 검체에서의 HCV Ag 검사와 HCV RNA 결과 (Amplicor Monitor®) Positive Negative Total HCV Ag (Trak-C®) (+) 19 19 (-) 5 26 31 Total 24 26 50

Fig. 2. 치료 전후 환자군 검체에서의 HCV Ag 정량검사와 HCV RNA정량결과

결 론 50 개의 PCR 양성 검체를 대상으로 한 결과 4개의 검체에서 Trak-C HCV Ag 검사결과가 음성 결 론 50 개의 PCR 양성 검체를 대상으로 한 결과 4개의 검체에서 Trak-C HCV Ag 검사결과가 음성 → 1,000~8,000 IU/mL 정도의 저농도에서 검출한계 공혈자의 항체형성 이전의 항원 선별검사 및 항체 형성이전의 환자의 진단에 유용 → 효소면역검사법으로서 대량검사 가능, 비용, 시간 측면에서 기존의 PCR 등 핵산검사방법과 비교하여 우수한 결과. HCV RNA PCR 검사는 다른 검사법들에 비해 어렵고 비용과 시간소요가 크며 위양성율도 고려해야함. → 본 HCV 항원 검사는 진단이나 치료반응 추적검사 목적의 HCV RNA PCR 정량 검사와도 상관성이 비교적 좋음.

즉, Trak-C HCV Ag 검사는 일반 clinical laboratory에서도 쉽고 간편하게 실시할 수 있는 효소면역법 검사법임. 정량검사로서, 진단이나 치료반응 추적검사 목적에도 유용할 것으로 판단됨.