핵산의 성질과 분리 생물환경학과 김 정 호

유전자 조작에 의한 인슐린 생산 과정

유전자조작 과정 1. DNA 추출 및 정제 2. 제한효소 처리 3. 재조합 DNA 만들기 4. 숙주세포에 재조합 DNA 도입 5. 목표 유전자를 가진 형질전환균주 선발 6. 물질 생산

유전자조작에 필요한 것들 유전자 제한효소(restriction enzyme) 유전자 운반체(cloning vector) 숙주세포(host cell) DNA 연결효소 (DNA ligase) Alkaline phosphatase etc.

유전자는 어디에서? 유전자 공여세포 : 사람, 동물, 식물, 미생물 cDNA 합성 DNA 염색체 DNA 추출, 정제 제한효소로 잘라서 적당한 크기의 것을 사용 : 전기영동 cDNA mRNA로부터 역전사효소(reverse transcriptase) 이용 합성 합성 DNA DNA 합성기 사용 조각을 합성 후 연결

DNA는 어떻게 자르나? 제한효소(restriction endonuclease)

재조합 DNA는 왜, 어떻게 만드나? 왜 유전자 운반체를 사용하나? 어떻게 재조합 DNA (Recombinant DNA)를 만드나? 유전자 + 유전자 운반체(cloning vector) DNA 연결효소 (DNA ligase) 운반체의 종류는? 플라스미드 (plasmid) 파아지 (phage) : lambda, M13 코스미드 (cosmid) : cos (from lambda) + plasmid 인조염색체(artificial chromosome)

어떤 생물체에, 어떻게 넣나? 숙주 (host cell) 어떻게 넣나? 미생물 Escherichia coli Bacillus subtilis Saccharomyces cerevisiae … 식물 동물 어떻게 넣나? 형질전환 (tansformation) 전기천공 (electroporation) particle bombardment

형질전환균주는 어떻게 선발하나? 형질전환균주 (transformant)

DNA의 변성과 재생 DNA Hydrogen bond DNA의 변성 (Denaturation) Backbone : Phosphodiester bond Covalent bond (공유결합) Strand-Strand : 상보적 염기쌍 형성 Hydrogen bond (수소결합) Hydrogen bond Weak bond : Temperature, pH , … DNA의 변성 (Denaturation) 온도, pH 상승, 변성제 → 수소결합 파괴 → DNA의 가닥 분리 DNA의 재생 (Renaturation) 변성된 DNA가 원래 상태로 (ss → ds)

λmax (흡수최대파장, maximum absorption wavelength) DNA, RNA : 260 nm Protein : 280 nm 흡광증가효과 (Hyperchromic effect) DNA가 변성/분해되면 흡광도가 증가하는 현상 dsDNA A260 = 1.0 ssDNA A260 = 1.4 (H-bond 분해) Nucleotide A260 = 1.4 (H-, phosphodiester-bond 분해) * RNA?

DNA의 변성 온도 (Tm) Tm (Melting Temperature) A260의 값이 최대치의 ½ 50%의 변성이 일어났을 때 G+C 함량에 따라 다름 - GC : 3 H-bonds, AT : 2 H-bonds pH, ionic strength에 따라 다름 변성제 : 강력한 수소결합 DNA의 H-bond 파괴 urea, guanidine formaldehyde formamide

핵산 혼성화 (Hybridization) 핵산 혼성화 (Nucleic acid Hybridization) . 서로 다른 유래의 단일가닥 DNA가 상보적으로 결합하여 이중가닥 DNA를 형성 하는 것 (Hybrid Duplex) . DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA . Southern blot : DNA Northern blot : RNA Western blot : Protein Eastern blot : Protein (번역 후 수식) FISH(Fluorescence in situ hybridization) to detect and localize the presence or absence of specific DNA sequences on chromosomes.

DNA와 RNA의 안정성 DNA와 RNA Deoxyribose vs. Ribose 2’-H 2’-OH 3’-OH 3’-OH DNA : stable at room temperature and alkaline pH RNA : unstable, storage at -70℃ RNase : very stable Rnase-free DNase

RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) 무작위로 증폭된 다형성 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 제한효소 절편길이 다형성 PCR (Polymerase Chain Reaction) 중합효소 연쇄반응 RT-PCR (Reverse transcriptase PCR)

DNA 분리, 정제 분리/정제 방법의 조건 . 순도 (Purity) : 불순물 (Protein, RNA, phenol) . 효율 (Efficiency) . DNA의 구조와 성질 변화 : 분해, 변성 . Simplicity . Plasmid DNA Chromosomal DNA Phage DNA

Isolation of Plasmid DNA Plasmid DNA 분리(preparation)의 과정 1. Growth of the bacterial culture How to make cells to have more plasmids? 2. Harvesting and lysis of the bacteria How to prepare cell lysate (cell extract)? 3. Purification of plasmid DNA How to remove protein, RNA, and chromosomal DNA? How to obtain concentrated, pure plasmid DNA?

Isolation of Plasmid DNA – Alkaline Lysis How to make cells to have more plasmids? Antibiotic resistance genes How to prepare cell lysate? SDS (Sodium dodecyl sulfate), NaOH How to remove protein, (RNA), and chromosomal DNA? Chromosomal DNA vs Plasmid DNA Alkaline lysis (pH 12.0-12.5) Chromosomal DNA, protein : denatured/digested precipitated after the addition of acetate-containing neutralization buffer Plasmid DNA : remains stable stay in solution after neutralization Centrifugation

Isolation of Plasmid DNA – Alkaline Lysis How to obtain concentrated, pure plasmid DNA? Phenol/Chloroform : denaturation of protein like DNase Cold Ethanol(Isopropanol) precipitation Silica adsorption Ion exchange chromatography Commercial kits available!

Isolation of Plasmid DNA – Alkaline Lysis

Plasmid Preparations Kits Minipreparation : a colony, ~ 5 mL culture / 50~100 µg DNA Midipreparation : 15~25 mL culture / 100~350 µg DNA Maxipreparation : 100~200 mL culture / 500~850 µg DNA Megapreparation : 500 mL~2.5 Ln culture / 1.5~2.5 mg DNA Gigapreparation : 2.5-5 L culture / 7.5~10 mg DNA The plasmid DNA yield will vary depending on plasmid copy number plasmid type and size bacterial strain growth conditions kit