생쥐 실험계에서 키틴 및 키토산의 섭취에 의한 식품 알레르기 억제 김은경, 손동화 한국식품연구원 식품기능연구본부

연구목적 최근 아토피성 피부염 및 천식, 식품알레르기를 비롯한 여러 알레르기 환자가 급증하고 있음. 알레르기 질환은 현재까지 정확한 원인물질의 규명이 어려운 경우도 있고 그 발증기작이 모호한 경우도 많은 실정임. 이들의 치료법 중 가장 확실한 방법은 기본적으로 원인물질을 회피하는 것인데, 해당식품의 섭취를 배제함으로서 영양불균형을 초래하는 등 많은 어려움이 존재함. 알레르기 증상에 대응하는 치료약들이 일부 활용되고 있으나 부작용의 문제가 있으며 근원적인 해법이 되고 있지 못하는 경우가 대부분임. 키틴 및 키토산은 안전성이 우수하며, 마크로파지 활성화, 콜레스테롤 저하, 항균작용, 혈압강하, 비피더스 생육, 항지혈, 항비만, 항암, 항당뇨, 뇨산대사 촉진 등 다양한 생리활성이 보고되고 있음. 이와 반면 키틴 및 키토산의 알레르기 억제활성에 대한 구체적인 연구는 매우 부족한 실정임. 본 연구는 α-키틴, β-키틴 및 β-키토산의 식품알레르기억제 활성에 대한 과학적인 자료를 제시하고, 활성이 우수하며 부작용이 없는 알레르기 억제 식품소재의 생산기술을 개발하고자 하였음.

재료 및 방법 1. α-키틴, β-키틴 및 β-키토산의 입자화 1. α-키틴, β-키틴 및 β-키토산의 입자화   키틴 및 키토산 분말을 입자크기 20 μm 이하로 만들기 위하여 Planetary mill 을 사용하여 초미세 분쇄하고 100 stainless steel mesh (pore size, 150 μm)로  1차 sieving하여 분쇄 시 남아있을 수 있는 소수의 큰 입자들을 제거함. 이를 다시 635 stainless steel mesh (pore size, 20 μm)로 sieving 하여 최종적으로 입자크기가 20 μm 미만의 시료를 회수 함. α-키틴, β-키틴 및 β-키토산 의 입자크기 분석은  Particle size analyzer 를 이용하여 측정함. 2. 키틴 및 키토산이 함유된 실험식이 (pellet) 제조 마우스에게 섭취시킬 실험식이의 기본은 AIN-76A 사료를 기본으로 하였으며 각각에 키틴 및 키토 산 시료가 0.2 % 되게 첨가함                 3. In vivo 실험계를 이용한 알레르기 억제 활성 실험    실험용 쥐는 C3H/HeJ (Female) 4주령을 총 40마리를 구입하여 각각 8마리씩 총 5그룹으로 나누 어 실험에 사용함. Sham treated 및 naive 군은 정상 식이를 섭취시켰고, α-키틴, β-키틴 및 β- 키토산 그룹은 각각의 키틴 및 키토산이 0.2 % 함유되어 제조된 사료를 섭취 시킴 4.경구투여에 의한 땅콩 알레르기 유발

Fig1. Experimental protocol: Mice were sensitized on weeks 2 (0,1,2 day) and 3 weeks and boosted on 5 weeks with ground whole peanut (10 mg) plus cholera toxin (20 μg) and ground whole peanut (50 mg) plus cholera toxin (20 μg), respectively. Mice were challenged on 7 weeks with ground whole peanut ground whole peanut (200 mg). Mice in group 4 and 5 were fed regular diet. Mice in group 1, 2 and 3 were fed 0.2 % α-chitin, β-chitin, and β-chitosan in diet pellet for 6 weeks, respectively.

2 눈과 입 주위가 부품, activity 떨어짐, 호흡수가 떨어짐, 설사 5. systemic anaphylactic symptoms 측정 (5단계)   0 아무런 증상 없음 (자유롭게 뛰어다님) 2 눈과 입 주위가 부품, activity 떨어짐, 호흡수가 떨어짐, 설사 1 코와 머리 주위를 scratching 또는 rubbing 3 숨을 헐떡임, 힘든 호흡, 입과 꼬리의 청색증 4 자극 후 no activity, 경련, 떨림 5 죽음 6. 혈청에서  specific IgE,  IgG1및 IgG2a 농도 측정 7. cytokine (IL-4, IL-5, IL-13, IL-12, IFN- ϒ) 분석

결과 입도분포 Fig.2 Determination of size distribution of α-chitin particles ( < 20 μm )

알레르기 전신반응 Fig.3 Murine systemic anaphylaxis induced by peanut.

혈중 Ig class 농도 Fig.4 Levels of peanut-specific serum IgE. Fig.6 Levels of IgG2a.

Th2 사이토카인 분비 a b b b b Fig.7 IL-5 levels in culture supernatants of splenocytes. Different letters indicate significant difference (p<0.01)

Th2 사이토카인 분비 a b c,b c c Fig.8 IL-10 levels in culture supernatants of splenocytes. Different letters indicate significant difference (p<0.001)

Th2 사이토카인 분비 a b c d e Fig.9 IL-13 levels in culture supernatants of splenocytes. Different letters indicate significant difference (p<0.001)

Th1 사이토카인 분비 a b b,c b,c c Fig.10 IL-12 levels in culture supernatants of splenocytes. Different letters indicate significant difference (p<0.001)

Th1 사이토카인 분비 Fig.10 IFN-γ levels in culture supernatants of splenocytes.

결론 이상의 결과를 종합해 보면, α-키틴, β-키틴, β-키토산은 모두 땅콩 알레르기 억제에 효과가 관찰되었으나, 대체로 α-키틴이 더 양호한 것으로 나타났다. 하지만 일부 사이토카인 (IL-10, IFN-ϒ) 분석에서는 오징어 유래 β-키틴 및 β-키토산이 상대적으로 높은 알레르기 억제활성을 보였다. 앞으로 섭취기간을 현재의 6주보다 더 길게 늘려 실험을 할 경우에는 그 차이 (효과)를 좀 더 명확하게 관찰할 수 있을 것으로 예상한다. 본 연구에서 제시한 가공 처리기술 등 기본적인 정보를 활용하면, 키틴 및 키토산을 이용한 알레르기 질환 완화/억제용 건강기능식품의 개발이 가능할 것이다. 아울러 이러한 활용은 건강기능식품 산업의 경쟁력 제고에 기여할 것으로 생각한다.

요약 키틴 및 키토산의 경구섭취에 의한 식품 알레르기 억제효과를 조사하고자 생쥐를 이용하여 in vivo 및 in vitro 실험을 행하였다. 키틴 및 키토산 입자를 초미세분쇄하여 20 μm 이하로 입자화하고 표준사료 (AIN-76)에 각각 0.2% 첨가한 펠렛 사료를 C3H/HeJ에 6주간 자유 섭취시키면서 땅콩과 cholera toxin (CT)을 경구투여하여 식품알레르기를 유발시켰다. 먼저 in vivo 실험에서 α-키틴, β-키틴, β-키토산을 함유한 사료 섭취군(증상수치: 각각 1.25, 1.50, 1.63)에서는 sham 처리군 (양성대조군, 증상수치: 2.17)에 비하여 전신성 알레르기 증상의 발증이 완화되었다. 이때 혈중 항체가 (특이 IgE, 전체 IgG1, 전체 IgG2a 항체)를 비교하였을 때 α-키틴 처리군에서는 알레르기 억제효과가 모두 나타났으나 β-키틴과 β-키토산 처리군의 경우에는 부분적으로만 그 효과를 나타내었다. 생쥐의 비장세포 배양에 의한 in vitro 사이토카인 분석결과에서, sham 처리군에 비하여 α-키틴, β-키틴, β-키토산 처리군에서는 모두 Th2 사이토카인 (알레르기 유발성)인 IL-5, IL-10의 분비가 명확하게 억제되었으며, 그 중에서도 α-키틴 및 β-키틴의 활성이 강하였다. 그런가 하면 α-키틴, β-키틴, β-키토산 은 Th1 사이토카인 (알레르기 억제성)인 IL-12의 분비를 촉진하였으나 그 정도는 미약하였다. 또한 β-키토산 처리군에서만 IFN-r (Th1 사이토카인)의 분비가 촉진되었다. 종합하면, α-키틴, β-키틴, β-키토산은 정도의 차이는 있으나 모두 생쥐의 땅콩 알레르기 억제에 효과가 관찰되었으며, 이를 발전시키면 식품 알레르기를 억제하는 기능성식품의 개발에 활용할 수 있을 것으로 생각한다.