Hsp90 inhibitor를 이용한 암세포 억제 기술 동향 2006024117 박상윤

Hsp (heat shock protein) 90 목차 1 Hsp (heat shock protein) 90 - 구조 및 기능 - 작용기작 2 암세포에서 Hsp90의 발현 확인 - 면역 조직 화학 염색법 - Western blot analysis 3 Hsp90 억제제 - MTT assay 확인 - Hsp90 억제제의 효과 증진 방법 4 Hsp90 억제제의 발전 가능성 5 결론 6 참고문헌

1.Hsp (heat shock protein) 90 고온이나 심한 스트레스성 환경에서 주로 발현 Hsp70에 의해 어느 정도 folding이 이루어진 metastable 한상태의 단백질에 합하여 folding을 완성 다양한 kinase, 전사조절 인자, 신호전달 물질, 효소 등의 안정화와 활성을 조절 세포 내에 불안정한 단백질의 완충제로서의 역할 HSP90은 분자 샤페론의 일종 리보솜에서 최초로 합성된 단백질은 실처럼 늘어져 있다가 뭉쳐진 형태의 미성숙한 폴리펩티드 형태를 띄고 있다. 이후 아미노산 곁사슬 간의 상호작용으로 수소결합이나 이황화결합등이 이루어 지면서 에너지 소모없이 자연스럽게 정상적인 접힘이 일어나 완전한 단백질로 성숙된다. 하지만 일부의 경우 접힘이 제대로 일어나지 못하거나 비정상적인 접힘이 일어나 성숙한 단백질이 되지 못하는데 이러한 경우 샤페론의 도움을 받게 된다. 고온 스트레스성 환경에서 발현 90은 분자량은 나타냄 다이머 구조를 취하고 있음, 이 구조는 진화적으로 잘 보존되어 있어 효소나 다른 동물도 비슷한 형태를 취함 구조 N말단 : ATP결합부위 중간도메인 : 표적 단백질과 결합 C말단 : 다이머 구조형성, 보조 샤페론결합 Luke Whitesell & Susan L. Lindquist Hsp90 and the Chaperoning of Cancer: Inhibiting Hsp90 Function Nat Rev Cancer. 2005;5(10):761-772

1.Hsp (heat shock protein) 90 작용 기작 다섯가지 중간체를 거치는것으로 알려져 있습니다. Hsp90의 n-terminal에 ATP가 결합하면 주위의 lid 부분이 회전하여 ATP결합 주머니의 입구를 덥는 형태가 됨 각 단량체 n-terminal의 b-stand의 상호교환이 일어나면서 추가적인 구조변화에 의한 닫힌(closed) 형태의 Hsp90 dimer가 형성된다. 닫힌 형태의 구조에서는 ATPase의 active site에 있는 arg380과 ATP의 r-phospate group과의 상호작용이 유도되어 ATP의 가수분해가 촉진된다 . ATP의 가수분해와 adp의 이탈과정을 거치면서 Hsp90 co-chaperone들의 역동적인 결합과 다양한 형태의 Hsp90 복합체 형성은 Hsp90의 이러한 구조적인 변화가 다양한 client protein에 대한 조절기능을 가능하게 하는 중요한 요소로 여겨지고 있다. 이과정이 HSP90 기능에 필수적인 요소로 알려지고 있다 Hahn JS (2009) The Hsp90 chaperone machinery:from structure to drug development. BMB Rep 42(10):623-630

형질 전환 과정에서 생겨난 v-src, bcr-abl , p53 단백질 까지도 안정화 2. 암세포에서 Hsp90의 발현 확인 암세포와의 연관성 형질 전환 과정에서 생겨난 v-src, bcr-abl , p53 단백질 까지도 안정화 암 의로서의 특징을 가지게 해주는 요소들의 안전성과 활성을 조절해줌 또한 Hsp90은 불안정한 상태의 단백질을 보호함으로써 생물체의 진화를 유발함이 알려져 있는데 형질전환 과정에서 생겨난 v-src, bcr-abl, p53등의 불안정한 돌연변이 단백질들이 Hsp90에 의해 안정화 됨으로써 암세포로의 분화가 촉진되는 결과를 초래하게 된다. 암세포 분화 촉진 - 암세포 주변의 환경조건 (hypoxy pH, 영양분의 고갈) 또는 암 유발 단백질을 활성화 시키는 스트레스 조건이 Hsp90의 발현 및 활성 유도

2. 암세포에서 Hsp90의 발현 확인 면역 조직 화학 염색법 일반 조직과 유방암 조직을 대상 으로 단일클론항체인 anti-Hsp70 과 anti-Hsp90 를 이용하여 면역조직 화학 염색법을 시행 실제 실험을 통해서 암세포에서의 HSP90 발현을 확인할수 있다 Hee Joon Kang, Mi-Kyoung Hong, Sung Ku Jung, Lee Su Kim The Role of Heat Shock Proteins 70/90 as Potential Molecular Therapeutic Targets in Breast Cancer J Breast Cancer 2007; December 10 (4): 231-40

2. 암세포에서 Hsp90의 발현 확인 Western blot analysis 1 : MDA-MB 435 3 : MDA-MB231 LC3 4 : MDA-MB231 GFP 5 : MDA-MB231 BR3 6 : MCF-7 7 : T-47D 세포주 안에 수용체라는 매개체가 존재하면 양성, 없으면 음성 암의 발병 형태나 위치가 다르고 형질전환이 일어났어도 HSP90은 발현된다는 사실을 확인 Hee Joon Kang, Mi-Kyoung Hong, Sung Ku Jung, Lee Su Kim The Role of Heat Shock Proteins 70/90 as Potential Molecular Therapeutic Targets in Breast Cancer J Breast Cancer 2007; December 10 (4): 231-40 호르몬 수용체 음성인 세포주 MDA-MB 435(1), MDA-MB 231 (2) 호르몬 수용체 양성인 세포주 MCF-7(6), T-47D (7) MDA-MB 231(2) 을 GFP 로 형질 전환한 세포주 MDA-MB 231GFP (4) 뇌와 폐로 장기 특이적인 전이를 일으킨 세포주 MDA-MB 231BR3(5), MDA-MB 231LC3 (3)

3. hsp90 억제제 직접적 효과 heat shock factor (HSF) 의 활성화-> HSP70 발현 현재까지 가장 많이 개발된 Hsp90 억제제는 Hsp90 Nterminal에 존재하는 ATP pocket에 결합하여 ATPase의 기능을 억제한다. 또한 C말단의 보조 샤페론의 결합을 억제하는 억제제도 발견되고 있다, heat shock factor (HSF) 의 활성을 억제하는 기능을 가지고 있어서 Hsp70등의molecular chaperone들은 세포 사멸 억제를 비롯하여 스트레스로부터 세포를 보호하는 기작을 가지고 있다 Luke Whitesell & Susan L. Lindquist Hsp90 and the Chaperoning of Cancer: Inhibiting Hsp90 Function Nat Rev Cancer. 2005;5(10):761-772 heat shock factor (HSF) 의 활성화-> HSP70 발현 -> 세포 사멸 억제, 스트레스로부터 세포를 보호 간접적 효과

3. hsp90 억제제 MTT assay 확인 MTT assay는 세포증식 활동 측정 실험으로 미토콘드리아의 활성을 확인하는 실험이다 DMSO는 억제제를 녹이는 용매로 대조군으로써 사용됨 농도가 높아질수록 세포의 증식이 비례적으로 줄어드는 것을 확인할수 있음 하지만 기대했던 것만큼의 효과는 내지 못함 있는 환원효소(reductase)에 의해 환원되어 포마잔 (formazan)이라 불리는 물질을 형성하게 된다. 죽은 세포는 미토콘드리아가 없기 때문에 환원효소도 존재하지 않고 따라서 포마잔도 형성되지 않는다 Hee Joon Kang, Mi-Kyoung Hong, Sung Ku Jung, Lee Su Kim The Role of Heat Shock Proteins 70/90 as Potential Molecular Therapeutic Targets in Breast Cancer J Breast Cancer 2007; December 10 (4): 231-40

Confocal Microscope를 이용하여 관찰한 ALF와 Cytochrome C 3. hsp90 억제제 Hsp90 억제제의 효과 증진 방법 공초점 현미경을 이용하여 녹색형광물질을 넣은후 세포주를 확인함 VPA는 항 경련제의 일종으로 히스톤 탈아시틸화 효소 억제제임. 유전자의 발현을 조절하여 암을 억제하는 효과를가짐. ALF는 (apoptosis inducing factor) 발현이 증가할수록 세포 자멸사가 일어남 cytochrome C 는 미토콘드리아의 에너지 생성과정에 필요하지만 세포질로 유출될 겨우 세포자멸사를 유도한다 히스톤은 DNA에 친화성을 갖고 있어서 DNA는 핵 안에서 히스톤을 둘러싸 콤팩트한 염색질을 형성한다. 그러나 장기 기억을 형성하려면 유전자가 발현되어야 하는데, 그러기 위해서는 염색질을 열어 히스톤에 감긴 DNA를 풀어야 한다. 이 과정에서 CBP는 히스톤의 아미노산(라이신)을 아세틸화하고, 이는 히스톤의 DNA에 대한 친화력을 저하시켜 유전자가 발현되는 것을 도와준다. 이러한 과정을 역전시킴으로써 크로마틴을 압축시키는 작용을 하는 효소가 바로 HDAC(histone deacetylase)이다. UCI의 연구진은 이번 연구에서 HDAC 저해제가 염색질을 느슨하게 함으로써 기억형성을 강화시킨다는 사실을 입증한 것이다. "HDAC 저해제가 암(癌)뿐만이 아니라 기억력, 암, 신경퇴행성질환, 나아가 약물중독과 기타 정신질환에까지 영향을 미칠 수 있다는 것은 매우 흥미로운 일이다."라고 연구진은 말했다. Confocal Microscope를 이용하여 관찰한 ALF와 Cytochrome C Jun-Young Park, D.D.S.,M.S.D., Se-Jin Park, D.D.S.,M.S.D., In-Ryoung Kim, M.S.,Ph.D.,Apoptotic Effect of Co-Treatment with Valproic Acid and 17AAG on Human Osteosarcoma Cells 대한구강내과학회지Vol. 36, No. 1, 2011

4. Hsp90 억제제의 발전 가능성 헌팅턴씨병, 뇌졸중등 활용 가능성 남아 있는 문제점 1 용해도, 복잡한 합성 방식, 대사 산물의 독성등의 문제점. 파킨슨씨병 퇴행성 신경 질환 2 다양한 client protein의 접힘 또는 안정화를 도와주는 구체적 기작에 대한 규명 헌팅턴씨병, 질병 유발 단백질의 축적과 응집을 동반 한다는 공통점을 가지고 있음 HSP90억제제를 통해서 이러한 질발유발 단백질을 제어할수 있을것이라고 봄 Hsp90는 chaperone 유전자의 발현을 유도 하는 전사 조절인자인 heat shock factor (HSF) 의 활성을 억제하는 기능을 가지고 있어서 Hsp90 억제제는 HSF의 활성화를 유도 하여 molecular chaperone의 기능을 가진 heat shock protein들의 발현을 증가 시키게 된다. hsp90의 기능 억제는 폭넓은 암 유발 인자를 동시에 억제할수 있다는 점에서 각각의 암 유발 인자를 타켓으로 하는 경우에 비해 효과 및 응용 범위 면에서 우위를 가지고 있다. 앞으로 보다 효과적이고 독성이 적으면서 한편으로 그 작용 기작이 좀더 세분화 되어 선택적 적용이 가능한 다양한 hsp90 억제제의 개발은 암 및 질병 치료에 획기적인 전기를 마련 할수 있을 것이다. 뇌졸중등 HSP90은 heat shock factor (HSF) 의 활성을 억제하는 기능을 가지고 있어서 억제제를 사용하면 Hsp70등의molecular chaperone 발현을 유도하여 세포 사멸 억제를 비롯하여 스트레스로부터 세포를 보호하는 기작을 가지고 있다.

5. 결론 hsp90의 기능 억제는 폭넓은 암 유발 인자를 동시에 억제할수 있다는 점에서 각각의 암 유발 인자를 타켓으로 하는 경우에 비해 효과 및 응용 범위 면에서 우위를 가지고 있다. -앞으로 보다 효과적이고 독성이 적으면서 한편으로 그 작용 기작이 좀더 세분화 되어 선택적 적용이 가능한 다양한 hsp90 억제제의 개발은 암 및 질병 치료에 획기적인 전기를 마련 할수 있을 것이다. hsp90억제제는 퇴행성 신경질환등 다른 질병의 치료제로써 활용될 가능성도 내포하고 있다는 점에서 더욱 많은 기대를 불러 일으킬 것이다.

6. 참고문헌 Ⅳ. 참 고 문 헌 [1] Luke Whitesell & Susan L. Lindquist Hsp90 and the Chaperoning of Cancer: Inhibiting Hsp90 Function Nat Rev Cancer. 2005;5(10):761-772 [2] Ellen A. A. Nollen and Richard I. Morimoto Chaperoning signaling pathways: molecular chaperones as stress-sensing ‘eat shock’proteins Journal of Cell Science 115, 2809-2816 (2002) [3] Hahn JS (2009) The Hsp90 chaperone machinery:from structure to drug development. BMB Rep 42(10):623-630 [4] Avrom J. Caplan What is a co-chaperone? Cell Stress Chaperones. 2003 April; 8(2): 105–107. [5] D Mahalingam1, R Swords1, J S Carew1, S T Nawrocki1, K Bhalla2 and F J Giles1 Targeting Hsp90 for cancer therapy British Journal of Cancer (2009) 100, 1523–1529 [6] Hee Joon Kang, Mi-Kyoung Hong, Sung Ku Jung, Lee Su Kim The Role of Heat Shock Proteins 70/90 as Potential Molecular Therapeutic Targets in Breast Cancer J Breast Cancer 2007; December 10 (4): 231-40 [7] Jun-Young Park, D.D.S.,M.S.D., Se-Jin Park, D.D.S.,M.S.D., In-Ryoung Kim, M.S.,Ph.D.,Apoptotic Effect of Co-Treatment with Valproic Acid and 17AAG on Human Osteosarcoma Cells 대한구강내과학회지Vol. 36, No. 1, 2011 [8] Masahiro Waza1,2, Hiroaki Adachi1,2, Masahisa Katsuno1, Makoto Minamiyama1, Chen Sang1, Fumiaki Tanaka1, Akira Inukai1, Manabu Doyu1 & Gen Sobue 17-AAG, an Hsp90 inhibitor, ameliorates polyglutamine-mediated motor neuron degeneration Nature Medicine 11, 1088 - 1095 (2005) [9] Wenjie Luo, Fei Dou , Anna Rodina Sophorn Chip, Joungnam Kim, Qi Zhao, Kamalika Moulick , Julia Aguirre , Nian Wu , Paul Greengard , and Gabriela Chiosis Roles of heat-shock protein 90 in maintaining and facilitating the neurodegenerative phenotype in tauopathies PNAS May 29, 2007 vol. 104 no. 22 9511-9516 [10] Ruth A. Bodner, Tiago Fleming Outeiro, Stephen Altmann, Michele M. Maxwell, Stephanie H. Cho, Bradley T. Hyman , Pamela J. McLean , Anne B. Young, David E. Housman , and Aleksey G. Kazantsev Pharmacological promotion of inclusion formation: A therapeutic approach for Huntington’s and Parkinson’s diseases PNAS March 14, 2006 vol. 103 no. 11 4246-4251

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