아미노산(Amino acid) Amino acids - 아미노산의 기본 구조 - 아미노산의 종류 비극성 지방족 아미노산 : Glycine, Alanine, Proline, … 극성 중성 아미노산 : Serine, Threonine, Cysteine, … 산성 아미노산 : Aspartic acid, Glutamic acid 염기성 아미노산 : Lysine, Arginine, Histidine 방향족 아미노산 : Phenylalanine, Tyrosine, Tryptophan 황함유 아미노산 : Methionine, Cysteine http://bioenv.sunchon.ac.kr

아미노산 표기법 Alanine Ala A Methionine Met M Cysteine Cys C Asparagine Asn Aspatic acid Asp D Proline Pro P Glutamic acid Glu E Glutamine Gln Q Phenylalanine Phe F Argineine Arg R Glycine Gly G Serine Ser S Histidine His H Threonine Thr T Isoleucine Ile I Valine Val V Lysine Lys K Tryptophan Trp W Leucine Leu L Tyrosine Tyr Y

아미노산의 생합성 경로 Amino acid biosynthetic pathway - Pyruvic acid family : alanine, valine, leucine - Glutamic acid family : glutamic acid, glutamine proline, arginine - Aspartic acid family : aspartic acid, asparagine lysine, threonine, isoleucine, methionine - Aromatic amino acid(shikimic acid) family : phyenylalanine, tyrosine, tryptophan - Serine family : serine, glycine, cysteine - Histidine

아미노산의 이용 식품 풍미증진제 : MSG(mosodium glutamate) AspartameR(L-aspartidyl_L-phenylalanine methery ester) 항산화제 : Histidine, Cysteine 영양강화제 : Lysine, Methionine, Tryptophan, Threonine 의약품 Glutamine, Methionine, Ornithine DOPA(dihydroxyphenylalanine) : from Tyrosine, 파킨슨병 화장품 보습제 : threonine, serine, N-acetylglutamic acid Suntanning agent : urocanic acid(from histidine) 화학공업 : polymer 제조

아미노산 생산 단백질 분해 L-cysteine, L-cystine, L-leucine, L-asparagine, L-tyrosine 화학 합성 비용이 적다. D-형과 L-형 동시 생산 Glycine, DL-alanine, DL-tryptophan, DL-methionine 미생물 발효 1956. Corynebacterium glutamicum : Glutamic acid 축적 Glutamic acid, Lysine, 아미노산 유도체 생산

미생물을 이용한 아미노산 생산 직접 발효(Direct fermentation) 전구체 전환(Conversion of precursors) - Glycine → Serine - α-aminobutyric acid → Isoleucine - D-threonine → Isoleucine, Threonine, Tryptophan, Aspartic acid 효소 반응(Enzyme reaction) - Sterospecific amino acylase from Aspergillus oryzae 화학합성한 aetylated D-Aa로부터 L-Aa의 선택적 유리 - Amino acid dehydrogenase from Bacillus megaterium α-keto acid의 환원적 아미노화에 의한 아미노산 생산 L-alanine, L-leucine, L-phenylalanine

아미노산 생산 균주 아미노산 생산 : 정교한 대사조절이 이루어짐 사용 균주 대사조절을 파괴해야 대량 생산이 가능함 - 야생형 균주(wild type strains) : Corynebacterium - 영양요구 돌연변이주(auxotrophic mutants) 중간대사산물인 아미노산 유도체 : homoserine, citrulline, ornithine 가지달린 대사과정에서 생산되는 아미노산 : lysine, threonine, valine, tyrosine - 대사조절 돌연변이주(regulatory mutants) 중요 효소가 되돌림조절 작용을 받지 않은 돌연변이주 유사물질 내성 돌연변이주 영양요구 돌연변이주의 복귀돌연변이주

- 재조합 균주(Genetic recombination) 영양요구 돌연변이 & 대사조절 돌연변이를 한 균주에 원형질체 융합(protoplast fusion) 이용 - 유전자 조작 균주(Genietically Engineered Organism) 속도제한 효소(rate-limiting enzyme) 증폭 Gene dosage effect

Glutamic acid Glutamic acid(Glu, E) - 구조 : 산성 아미노산(2 –COOH) - 생합성 : Glutamic acid family (Glutamic acid, Glutamine, Proline, Arginine) - 이용 : MSG(monosodium glutamate) : GRAS 0 ~ 120 mg/kg/day * Chinese restaurnt syndrome - 생산 : 단백질 분해(콩 단백질, 밀 단백질(gluten)) 발효 생산 : Corynebacterium glutamicum, 1956

글루탐산 생합성

Glutamic acid 생합성 Glucose → Pyruvate (EMP pathway) Pyruvate → Acetyl CoA → α-Ketoglutarate (TCA cycle) α-Ketoglutarate → glutamic acid - Overproducer : Brevibacterium, Corynebacterium α-Ketoglutarate + NH3 + NAD(P)H + H+ → L-glutamic acid + NAD(P)+ + H2O * glutamate dehydrogenase * NH3 농도가 높아야 함 - Others (GS-GOGAT pathway) α-Ketoglutarate + NH3 + ATP + NADPH + H+ → 2 L-glutamate + ADP + Pi + NADP+

글루탐산 생산균 Corynebacterium glutamicum (Micrococcus glutamicus ) Brevibacterium lactofermentum, B. flavum, B. divaricatum Microbacterium ammoniaphilum Gram(+), Aerobic, Short rod or coccus(pleomorphic) Non-spore-forming, Nonmotile α-Ketoglutarate → succinate ↓ (α-Ketoglutarate decarboxylase) Isocitrate dehydrogenase와 glutamate dehydrogenase 공액화 I.D. : Isocitrate → α-Ketoglutarate : NADPH 생성 G.D. : α-Ketoglutarate → L-glutamate : NADPH 소모 Biotin 요구성 : 세포의 투과성 조절 용이

글루탐산 생산조건 발효전환 현상 세포의 투과성 조절 - biotin : suboptimal concentration (2 ~ 5 μg/liter) 과잉 존재하는 기질의 경우 제거 후 사용 - 부족 : 증식불량 과잉 : 증식 왕성, 생산량 감소(lactate 증가) - penicillin - 계면활성제 - 포화지방산

NH4+ pH 산소공급 온도 - 부족 : Glutamate 생성 안됨 - 과잉 : Glutamate → Glutamine, 증식 저해 pH - 최적 pH 7 ~ 8 산소공급 - 부족 : lactate, succinate 축적 과잉 : α-Ketoglutarate 축적 온도 - 30 ~ 35℃ - 온도가 높으면 글루탐산 생산량 감소, 젖산 생성 증가

Glutamic acid의 정제 분리 MSG 제조 - 발효액 농축 후 등전점 침전 - 발효액 농축 후 염산 분해하여 염산염으로 분리 MSG 제조 - glutamic acid를 NaOH로 중화하여 MSG로 - pH 7.0 이상이면 Disodium glutamate 생성 racemic mixture 생성 pH 6.5가 적당

라이신(Lysine) Lysine(Lys, K) - 염기성 아미노산( 2 –NH2) - 필수 아미노산(essential amino acid) - 식물 단백질에 부족 - 주로 식품, 사료의 영양강화제로 사용 - 생합성 : Aspartic acid family Thr, Ile, Met과 함께 가지달린 대사경로로 합성 - Corynebacterium glutamicum 변이주 이용 생산

Lysine 생합성 Aspartokinase Dihydropicolinate synthetase - Asp → Lys, Met, Thr, Ile 첫 번째 효소, key step - Lys+Thr에 의해 협력되먹임저해 (concerted feedback inhibition) Dihydropicolinate synthetase - Lys 합성 가지의 첫 번째 효소 - Lys에 의해 되먹임저해 Homoserine dehydrogenase - Met, Thr, Ile 합성가지의 첫째 효소 - Thr에 의해 되먹임저해 Met에 의해 되먹임억제

Lysine 생산균주 Corynebacterium glutamicum 대사조절 변이주 - Aspartokinase Lys + Thr에 의해 되먹임저해 되지 않는 균주 - Dihydropicolinate synthetase Lys에 의해 되먹임저해 되지 않는 균주 - Homoserine dehydrogenase Isoenzyme 아님 Thr + Met에 의해 협력되돌림조절되는 균주

영양요구 돌연변이주 * 대사조절 + 영양요구 돌연변이주 사용 - Homoserine dehydrogenase 결핍 Homoserine or Thr + Met 공급해야 증식 가능 Thr(suboptimal conc.) + Met(optimal concn.) 공급 → Aspartyl phosphate는 전량 Lys 합성에 사용 → Threoinine (suboptimal concn.) Lys + Thr에 의한 aspartokinase의 협력되먹임저해 없음 * 대사조절 + 영양요구 돌연변이주 사용