Mammalian cell culture Ⅲ (Real-time PCR)
실험 목적 Real-Time PCR RNA에서 cDNA로의 합성원리를 배우고 실습 Real-Time PCR 을 실습하고 세포에서 mRNA발현 정도 비교 분석
Introduction cDNA 1. 역전사효소 (reverse transcriptase) 2. 5X reaction buffer (dNTPs, Mg2+ …) 3. RNA 4. Nuclease free water(to 20μl) cDNA 합성 Kit
Introduction Real-Time PCR PCR의 원리 Real-time PCR의 증폭곡선
Introduction Real-Time PCR 증폭이 시작되는 지점 (표준곡선) 미지의 시료의 Ct값으로 상대적인 mRNA의 농도를 측정함
Introduction < < Real Time PCR Method (SYBR green vs TaqMan) TaqMan requires a sequence-specific probe that connects fluorophore and quencher SYBR Green 1 fluoresces only when bound to dsDNA specificity < expense Quencher < DNA polymerase의 endonuclease 기능에 의해 TaqMan probe로부터 flurophore가 분리되어 발광함
Materials & Methods cDNA synthesis cDNA 합성 kit, PCR machine, PCR tube cDNA 합성을 위해 tube에 표와 같이 순서대로 넣어준다. PCR machine 으로 cDNA합성 1) Priming 5min at 25’C 2) Reverse Transcription 20min at 46’C 3) RT inactivation 1min at 95’C 4) Optional step Hold at 4’C cDNA dilution : RNA 1μg로부터 동량의 cDNA가 합성되었다고 가정하면, 합성된 총 cDNA는 1μg/20μL = 50ng/μL 이후 real-time PCR에 사용되는 cDNA templete는 20ng 사용함. (합성된 cDNA 20 uL + 180 uL nuclease-free water = 200 uL) 구성 분주량 (μL) RNA 1μg에 해당하는 양 (μL) 5X reaction buffer 4 Rtase 1 Nuclease-free water (15 - RNA의 양) 합계 (μL) 20
Materials & Methods Real-Time PCR Real-Time PCR machine, primer, SYBR Green, 96well plate 96 well PCR plate의 정해진 위치에 cDNA 4ul 씩 loading Mixture (primer, DDW, SYBR Green) 16ul loading Cover Film 을 붙인다. Centrifuge 1000 rpm, 2 min Real time PCR machine 에 넣고 작동시킨다. 1 2 3 4 5 6 7 b-actin control Target gene b-actin Target gene WY
Results Real-Time PCR Ex) [실험결과] Ct 값 Target gene (Gene X) Reference Gene (β-actin) Control (대조군) 24 19 WY14643 (실험군) 22 20 Ct 값 dCt (Target – Ref) Control (대조군) 24 – 19 = 5 WY14643 (실험군) 22 – 20 = 2 [실험결과] 대조군 시료에 비해 실험군 시료에서 유전자 X의 발현이 8배 증가한 것으로 측정됨. Ct 값 ddCt Control (대조군) 5 – 5 = 0 WY14643 (실험군) 2 – 5 = -3 상대비율 2^ (-ddCt ) Control (대조군) 2^(-0) = 1 WY14643 (실험군) 2^(3) = 8
Real-Time PCR Results Ex) Relative mRNA level
Discussion Real-Time PCR Q1. 결과값을 통해서 WY14643이 유전자 X의 발현에 미친 영향에 대하여 서술하시오. Q2. A와 B사이의 Gene Y 발현량 계산하여 비교 분석하시오. Ct 값 Target gene (Gene Y) Reference Gene (β-actin) A (대조군) 25 18 B (실험군) 23 19