Instrumental Analysis UV/vis 흡수분광법 (Skoog. 14장)

에너지의 크기와 분광분석 UV/Vis Theory 분자의 전체의 전이에너지: Etotal= Eel (전자전이) + Evib (진동E) + Erot (회전E) + Etrans(병진 E) 한 개의 전자전이 에너지는 몇 개의 진동에너지 합과 유사하고, 한 개의 진동에너지는 몇 개의 회전에너지의 합과 유사하다. 즉, 이들의 에너지 크기 관계는: Eel> Evib> Erot 따라서 다음의 관계가 성립한다

전자전이와 에너지 UV/Vis Theory 흡광전자: 복사선 흡수와 관계 있는 전자. 원자 사이의 결합형성에 직접 참여하는 전자  산소, 할로겐, 황, 질소 원자 주위에 있는 비결합 또는 비공유전자. No-binding electron (n전자)   결합, 결합  Sigma 결합: 단일 공유결합 C  H 강하게 결합되어 있다. 강한 에너지가 여기에 필요(안정되어 있다)  Pi 결합: 2중 공유결합  -  결합  -  결합 2중 결합은 , 결합의 혼합 C  H  비교적 안정 8개

UV/Vis Theory  n전자: 산소, 할로겐, 황, 질소 등의 비공유 전자쌍 n전자 (비교적 불안정, 노총각전자)  sigma결합 H 분자의 전자 에너지 준위  전자분포: SKOOG 그림 14-1 (계단모양설명) * 反결합전자 * 反결합전자 4종의 전자전이 형태가 존재     n 비결합전자  결합전자  결합은 강하게 결합되어 안정성이 크므로, 여기에는 강한 에너지가 필요하고 이렇게 흡수된 강한 에너지는 여기 상태에서 존재하므로 그림처럼 높은 에너지 준위를 갖는다.외우지 말고 이해를 하자.  결합전자 전자전이에 필요한 에너지의 크기는  >  >  >  의 순서이지만, 일반적으로  , 은 명확하게 구분하지 않지만 n* 가 보통 조금 크다. 가 조금 크다는다. 즉, Excitation이 쉽게 일어나는 것은 이 에너지 크기의 역순이다. 파장과 에너지?

UV/Vis Theory  그러면, 모든  결합은 여기 에너지가 같다는 말인기요? No, I did not say such a thing! 결합수 와도 관계가 있다.  Sigma 결합: *전이 C  H 결합 4개: max 125 nm (C-H bond) H 결합 7개: max 135 nm (C-H, C-C bond) C  H  H  C   H 여기에 필요한 에너지는 구성원자의 수와 종류와도 관계한다. 예를 들면 같은 결합수라면 C-H bond가 C-C bond보다 더욱 안정. 즉, E. of 125 nm > E. of 135 nm 흡수파장 피크로서 결합의 안전성 판단 가능

UV/Vis Theory  n* 전이 : max < 200 nm (예, H2O, CH3OH, CH3Cl 등 교과서 표 14-2 참고)  * 전이(발색) & n*전이(조색): 200 < max < 700 nm (색소화학) 약한 띠 max는 봉우리의 세기를 의미(106 최대) 강한 띠

UV/Vis Theory E2 vs B 그리고 슬릿너비효과 B E2 슬릿너비효과(나비가 적으면 뚜렷해짐) E2 band :2s+2P 블록의 전이, B(bulk): 대부분의 분자구조에서의 전이. 탄소화합물은 모두 나옴 더 자세한 사항은 교과서“밴드이론”참고

UV/Vis Theory 발색단(chromophore): 분자가 색깔을 띠게 하는 작용기(n전자,  전자 등 불포화 작용기에 의한 전이). 넓은 의미: 화합물이 빛을 흡수하여 모든 종류의 전자전이를 일으키게 하는 작용기. 발색단: 발색단의 전자 전이는 용매에 따라 다르다. 교과서 표 참고(14-1, p341) 여기에 대한 규칙은, 용매의 극성  Blue shift Red Shift n* 전이 * 전이 (물, 에탄올 등) 왜 그럴까? 발색단을 이용한 단백질 농도 측정법:Lowry Assay REPORT!!

UV/Vis Theory 조색단(auxochromophore) 발색단이 빛을 흡수하는데 도움을 주는 작용기. 그 자신은 흡수하지 않는다. 산소, 할로겐, 황, 질소 원자 주위에 있는 비결합 또는 비공유전자 ex) -OR, -NH2, -NR, -OH, -X 발색단과 결합, 흡수파장을 장파장으로 이동(Red Shift), 흡수세기증가 N H C O H C 파장 Abs 조색단 피크 고에너지 max 예) Benzene 256 nm Phenol 270 nm (비공유 2) Aniline 280 nm (비공유 1) 조색단의 비공유가 2개면 1개보다 장파장에서 흡광해야 하는 것 아닌가? 다음페이지 참고 발색단의 conjugation: 발색단의 수와 파장 탄소의 수를 알 수 있다. C C C C C 중심체 2개 중심체 3개 높은 에너지로 여기 가능 낮은 에너지로 여기 가능 Red shift (흡수체가 많다)

참고: 조색단의 전기음성도와 관련하여 흡광피크가 차이가 있게 된다. 결합에 관여하는 조색단 주원자의 전기음성도가 크면 결합전자는 주원자 가까이에 위치하여 전자구름의 밀집도가 높아지게 되어 전자결합이 에너지를 흡수할 수 있는 공간점유가 작아지고, 진동파수가 커진다고 할 수 있다.

UV/Vis Theory 피크의 유무(괴로운 멜라닌색소) 인간의 eumelanin의 구조식의 일부 멜라민 색소가 많은 피부는 UV파장이 아니더라도 300-800 nm의 흡수를 한다. 이는 다양한 발색단과 많은 조색단이 있기 때문이다. 피크의 존재는 여기 상태로의 전환을 의미하며 작용기 숫자가 적을 때 일어난다. 주: 작용기의 종류가 많아 지면 바닥상태로 떨어지기 어렵고(왜 그럴까?) 따라서 열에너지가 많이 발생하게 된다.

Instrumental Analysis UV/vis Experiment (Skoog. 14장) 기기분석의 목적: 정성분석, 정량분석 광학분석의 목적: 정성분석, 정량분석

분석기기사용실태 2008년 10월 8일 촬영 4학년 1학기부터 학부생들이 사용

PSA(입도분석기) 현재 관이 막혀서 사용불가

UV/vis

DSC(열분석기) 셀이 부분파손됨 3개째+IR용 샘플제작기(2009년 1학기 파손)

GC(가스크로마토그래피)

HPLC(고성능액체크로마토그래피)

시약

FTIR 2007년 학생의 부주의로 내부창이 파손되어 새로 구입(6천만원) 2013년 고장(검출기 및 PowerSupply: 수리비 800만원)

흡광도 측정시 중요사항 UV/Vis Experiment 용매선택 가시광선: 모든 무색 용매 사용 자외선: H2O, 95% EtOH, Cyclo-hexane  용매는 투명하고 흡광 물질의 흡광 특성에 영향을 주지 않는 물질. 극성 용매는 용질의 진동 효과 스펙트럼 제거(SKOOG 그림14-1) 탄화수소와 같은 비극성 용매 사용 (SKOOG 그림14-6)  흡수 극대점도 용매에 의해 변화 (Red, Blue shift).  샘플이 많을 때는 같은 용매를 사용하여야 분석에 편리.  자외선 가시광선 용매 SKOOG 표 14-3(다음페이지)

UV/Vis Experiment SKOOG 그림 14-1: 용매의 선택과 흡수스펙트럼 특성

UV/Vis Experiment SKOOG 그림 14-6: 극성의 크기와 스펙트럼 극성이 강하면 더 폭이 넓다.

UV/Vis Experiment SKOOG 표 14-3: 범용용매의 사용가능 영역

UV/Vis Experiment 파장 일반적으로 적은 농도변화에 대하여 흡광도 변화가 적은 파장을 선택. 미묘한 변화에 대한 대응 및 실험영역을 넓게 할 수 있다. 스펙트럼의 도시 가로축은 파장, 세로축은 광학적 특성을 표시한다.  SKOOG 그림 14-10, 14-11 기본형 미분 흡광도는 산란효과 및 상세효과를 검증할 때 사용하는 경우가 있다.(교과서 참고 p348-351)

흡광도 측정에 의한 정량 분석(교과서 p26, 실험적방법) UV/Vis Experiment 흡광도 측정에 의한 정량 분석(교과서 p26, 실험적방법) Spectrum의 도시  보통 피장 vs (흡광도 OR 투광도)  간혹 파장 vs log(흡광도) 또는 파장 vs 미분흡광도 사용 알고자 하는 파장 영역을 선택하여 용액 속의 용질 농도에 따른 흡광도 측정 (즉, A= bc에서 c만 모르는 경우). 정량적 처리 0.15M Abs 0.1M 파장 1 2

UV/Vis Experiment 정량적 처리 (A= bc에서 ,c모두를 모르는 경우). 일반적으로 Beer의 법칙으로 적용한다 (’’ 을 알고 있을 때). ’’ 이 미지의 경우 표준물 첨가법 과 같은 기법으로 정량화 한다.  표준물 첨가법: 알고있는 표준물의 농도를 기준으로 정량화 하는 방법으로 표준물의 량을 변화시켜 실제 시료의 농도를 구한다. (교과서 1장 참고 p26)  표준 용액의 농도 (Cs), 량 (Vs) ex, 10 ppm hemoglobin  시료 용액의 농도 (Cx), 량 (Vx) ex, H2O내의 hemoglobin  시료의 량을 일정하게 한다. Ex, 10 cc, 20 cc.  샘플을 다음과 같이 다양하게 표준물의 량을 증가 시키는 방법으로 만든다. Sample 1: Vx= Vt1 (미지시료의 량=전체시료의 량) Sample 2: Vx + Vs = Vt2 (시료의 량에 동일한 량의 표준액 넣는다) Sample 3: Vx + 2 Vs= Vt3 Sample 4: Vx + 3 Vs=Vt4 중요: Vs를 독립변수화 시키고 있음. Sample 5: Vx + 4 Vs=Vt5 주의: 표준용액을 첨가함은 부피가 늘어남을 의미, 농도가 증가함을 의미하는 것이 아님. If, 1. 표준용액의 농도 > 시료의 농도 Vt5의 농도 > Vt4 > Vt3 > Vt2 > Vt1 Else 2. 표준용액의 농도 < 시료의 농도 Vt5의 농도 < Vt4 < Vt3 < Vt2 < Vt1

UV/Vis Experiment 1. 의 경우 전체 샘플에 대한 흡광도 변화는 다음과 같이 나타날 것이다. 1. 표준용액의 농도 > 시료의 농도 Vt5의 농도 > Vt4 > Vt3 > Vt2 > Vt1 Vt5 Abs 특정파장에서의 흡광도가 점점 커진다. Vt1(시료) 파장 2. 의 경우 전체 샘플에 대한 흡광도 변화는 다음과 같이 나타날 것이다. 파장 Abs Vt5 Vt1(시료) 2. 표준용액의 농도 < 시료의 농도 Vt5의 농도 < Vt4 < Vt3 < Vt2 < Vt1 특정파장에서의 흡광도가 점점 작아진다.

UV/Vis Experiment 이러한 샘플들에 대하여 Beer의 법칙을 적용하면(전체농도=표준용액+시료), A=bCx + bCs (: 물질이 같으므로 같다, Cx, Cs는 섞여 있으므로 부분농도이다.) 즉, A= Vs는 알고 있는 농도이지만 실험시 계속 변화하므로(독립변수) 이에 대하여 정리하면 Vs에 대하여 1차식 A= ‘K’ ‘m’ = mVs + K Vs를 Vs, 2Vs, 3Vs로 바꾸어 주면 Vs에 대하여 흡광도는 직선. 즉) A= mVs + K m=0에서 y절편=K Abs 1 2 3 4 5 샘플Number

UV/Vis Experiment A= mVs + K A= ‘K’ ‘m’ 실지로 y축 절편은 우리가 구할려는 값이지만, 그 값은 아직 알 수 없다. M 항과 K항은 공통적인 인수가 많으므로 K/m (절편/기울기)으로 단순화 해보면, K/m = = 우리가 알고자 하는 항은 Cx이므로 Cx에 대하여 전개하면 여기서, Cs, Vx, m은 알고 있는 수 이거나 실험을 통하여 구할 수 있다. 그러나 K는 y절편으로 알 수 없다. 즉, K를 알면 Cx를 알 수 있다. 다음 페이지 (K구하는 법)

UV/Vis Experiment 우리가 알고자 하는1번 샘플의 Cx는 다음의 두 가지 경우이다. 샘플 용액이 표준용액 보다 농도가 낮은 경우. Abs K 1 2 3 4 5 샘플Number 일치하지 않는 경우: 미실험 영역의 경우 수치적 해법에 의해 K를 구한다. UV/vis측정영역 밖의 농도인 경우 샘플 용액이 표준용액 보다 농도가 높은 경우. 일반적으로 같은 점 Abs K 1 2 3 4 5 샘플Number

UV/Vis Experiment 수치적 해법: 실험데이터가 아닌 가상의 데이터를 얻기 위한 수학적 방법. 최소 자승법: 정확한 상관관계(직선 혹은 곡선)을 얻기 위한 방법. 보간법: 정확한 데이터를 얻기 위하여 가공의 데이터를 만든다. 외삽법: 직선의 식(또는 곡선의 식)을 연장하여 데이터 영역 밖의 데이터를 추적. Excel, Sigma Plot, Origin, Mathematica, Matlab 등에서 할 수 있음. 컴퓨터 언어를 사용하여 구하는 것이 일반적임. 예제 14-1, 14-2 참고(p. 347) d, f전자 전이 금속계열의 전자전이 형태(p355~359). 교과서 참고 리포트: 요약(자필)

UV/Vis Experiment 실용예제: UV/vis를 이용한 Ca2+ 이온농도 측정 분필가루 (CaCO3) 를 물에 용해 하였을 때, 이온화 되는 Ca의 농도를 용해시간에 대하여 UV/vis로 측정하여 정량화 하라. 난용성 염이기 때문에 CaCO3를 녹이면 얼마나 해리되는 지 알 수 없다. Ca이온은 UV/vis 영역에서 흡광특성을 가지고 있지 않다. 이런 경우 발색단 및 조색단을 가지고 있는 물질(UV/vis영역에서 흡광특성을 가지는 물질)과 결합하는 Ca이온의 농도를 측정함 으로서 정량화가 가능하다. 그 과정은 분필가루는 이온화가 어려운 물질이기 때문에 CaCl2와 같은 물질로 이온화하여 Ca이온의 농도에 따른 흡광도 곡선을 측정한 후(calibration curve) 이를 기준으로 CaCO3중의 Ca이온의 농도를 알아낸다. 단 칼슘이온 몇 개가 발색단에 붙을 지 모르니 용해된 칼슘이온 농도보다 많은 결합사이트를 가질 수 있도록 발색단 농도를 조절하여야 한다. 일반적인 분석문제는 위의 경우처럼 제대로 된 이해가 없는 경우, 분석이 불가능한 경우가 많다.

UV/Vis Experiment Step 1: Ca2+이온과 결합하는 발색단을 가진 물질의 선택(Methyl Thymol Blue) Ca2+ 결합비=1:1  1:6(MTB의 농도에 의존) MTB의 구조 수용액에서 Na이온이 해리되면서 COO-이온형성: 4개 S=O 결합은 공유결합 형태로 이온화 하지 않지만, 전자밀도가 높아 여기에도 결합가능. OH는 염기성이 강하면 H+이온이 해리되어 나감. (결합사이트 7개) Ca이온이 붙는 것은 이온결합, 정전기적인력의 2가지 방법이다.

UV/Vis Experiment Step 2: CaCl2를 이용한 Ca이온 calibration(0.1 mM MTB사용) 칼슘농도와 흡광도는 1차식의 관계가 있다. 즉, 농도에 따른 흡광도는 하나의 값을 가진다. 632 nm에서의 흡광도의 크기는 Ca2+이온의 농도로 계산된다.

UV/Vis Experiment Step 3: CaCO3의 시간에 따른 이온해리도 측정 Error가 많은 영역: 대학원생의 실수 유사한 예로 단백질의 농도를 측정하는 Lowry assay의 방법이 있다.

Quiz: 다음현상의 원인은? 다음시간: 적외선 분광법의 기초 (SKOOG:16장)

Report는 수업시간 이미 냈습니다. 뭔가요?