Chapter 7. 흡광광도법 - Absorption spectrophotometry using spectrophotometer 기본 원리, 기기사용법 및 측정법 개요 및 원리 : 분광광도법 투광도 및 흡광도 Beer-Lambert Law Standard curve 1. 실험기기 : Spectrophotometer 기기사용법 및 주의사항 2. 경량, 내열 (파괴인성 크리프 강도(피로강도)) 실험재료 및 실험방법 3. 보고서 작성법 : 실험결과 및 Further study 4.

분광광도법 ( Absorption spectrophotometry ) 1. 개요 및 원리 빛 - 반사 , 흡수, 통과 흡광도 - 시료에 의해 흡수되는 빛의 양 - 시료의 농도에 비례 흡광광도법 ( Absorption spectrophotometry ) - 일정 파장에서 시료용액의 흡광도를 측정 → 목적 성분의 정량 - 자외선(180nm~320nm) 및 가시광선(329nm~800nm) Light 분광광도법 ( Absorption spectrophotometry ) 경량, 내열 (파괴인성 크리프 강도(피로강도))

투광도 (T) 및 흡광도 (A) I0 I 흡광도 ( Absorbance ) 1. 개요 및 원리 투광도 (T) 및 흡광도 (A) I0 I 흡광물질 비존재 흡광물질 존재 투광도 ( Transmittance ) T= I / I0 , %T= T X 100 - 시료를 통과한 입사광의 분율 - 투광도의 범위는 T <= 1 ex) %T=30 → 70%의 빛이 시료를 통과하지 못함 시료에 의해 빛이 전혀 흡수되지 않을 경우, T=1 모두 흡수되는 경우, T=0 - 투광도는 시료의 농도와 무관 흡광도 ( Absorbance ) A= log I0 /I = - log I/I0 = - logT 경량, 내열 (파괴인성 크리프 강도(피로강도)) I/I0 %T A 100 0 0.1 10 1 0.01 1 2

Cuvette의 직경이 빛의 투광율에 미치는 영향 1. 개요 및 원리 Beer-Lambert Law Cuvette의 직경이 빛의 투광율에 미치는 영향 I0 I 흡광물질 비존재 흡광물질 존재 투광도 ( Transmittance ) 와 흡광도 ( Absorbance ) T = I / I0 A = - logT = K x C ← Beer’s Law - 투광도는 시료의 농도와 무관하나, 그 로그함수 즉, - 흡광도는 , 1. 시료의 농도와 일정한 상관관계를 가짐 (c) 2. cuvette의 직경 또는 폭에 영향 받음 (l) 3. 물질 고유의 특성에 따라 달라짐 (e, 몰흡광계수 , molar absorptivity ) A = e l c A: absorbance, OD, 흡광도 c : molar concentration , 시료의 농도 (M) l : light path length, cuvette의 폭 (cm) e: molar absorption coefficient, 몰 흡광계수 ( M-1cm-1 ) 경량, 내열 (파괴인성 크리프 강도(피로강도))

Standard curve를 이용한 미지시료의 농도 정량 1. 개요 및 원리 Standard curve ? Standard curve를 이용한 미지시료의 농도 정량 흡광물질의 농도가 높은 경우 경량, 내열 (파괴인성 크리프 강도(피로강도)) 흡광도는 흡광물질의 농도에 비례 농도를 알고 있는 표준 시료의 용액에 대한 흡광도 → 미지농도 시료의 농도를 정량해냄 시료 중 흡광물질의 농도가 매우 높거나 낮은 경우, Beer’s law를 따르지 않게됨

Spectrophotometer 특정 파장의 빛이 화학물질에 의해 흡수되는 정도를 측정하는 기기 2. 실험기기 Spectrophotometer 특정 파장의 빛이 화학물질에 의해 흡수되는 정도를 측정하는 기기 큐벳(cuvette) 단색화 장치에서 나온 단색파장의 빛은 통로길이가 l 인 시료를 통과 시료는 큐벳(cuvette)이라고 하는 흡수용기에 넣음 * cuvette : 석영 (가시광선, 자외선 투과), 유리와 플라스틱 (자외선 흡수, 가시광선에서만 사용 가능) 흡광도를 측정할 때에는 대조액(blank)을 통해 base line을 잡음 * Blank : 흡광물질이 없는 용액 , 버퍼는 시료용액과 동일해야함 경량, 내열 (파괴인성 크리프 강도(피로강도))

Spectrophotometer 올바른 조작 방법 A= 0.2 ~0.9 범위의 값이 유의함 2. 실험기기 Spectrophotometer 올바른 조작 방법 큐벳(cuvette) A= 0.2 ~0.9 범위의 값이 유의함 각 시료의 최대 흡광도를 나타내는 파장에서 측정함 Cuvette은 표준화된 것을 사용함 시료중에 먼지가 포함되지 않도록 뚜껑을 닫거나 , 지문 흡착에 주의함 ( 먼지는 빛을 산란시켜 흡광도 증가를 유발할 수 있음 ) 경량, 내열 (파괴인성 크리프 강도(피로강도))

Materials and Methods Materials - Compound Y ( 410nm에서 최대흡광도의 물질) 3. 실험재료 및 실험방법 Materials and Methods Materials - Compound Y ( 410nm에서 최대흡광도의 물질) 10, 20, 40, 60 uM Y compound in 100mM Tris-Cl buffer and Blank - Spectrophotometer Methods 1) spectrophotometer의 wavelength를 410 nm로 설정 및 blank 측정 2) 농도가 주어진 4개의 compound Y 용액을 cuvette에 1mL 옮긴 후 spectrophotometer에서 O.D를 측정 3) 측정한 O.D 결과를 이용하여 Standard curve를 그림 4) compound Y의 몰 흡광계수를 구함 경량, 내열 (파괴인성 크리프 강도(피로강도))

Results e = 1. Absorbance & Standard curve 3. Molar absorptivity 4. 보고서 작성 Results 1. Absorbance & Standard curve Y (uM) OD 410nm 10 20 40 60 경량, 내열 (파괴인성 크리프 강도(피로강도)) 3. Molar absorptivity e =

4. 보고서 작성 Further study p.57 연습문제 경량, 내열 (파괴인성 크리프 강도(피로강도))

공지사항 보고서는 손글씨로 작성합니다. 2. 인터넷 등 각종 자료를 그대로 복사하는 경우 감점합니다 2. 인터넷 등 각종 자료를 그대로 복사하는 경우 감점합니다 3. Discussion 은 1-2페이지로 작성합니다 4. 자료 인용 시 반드시 Reference를 씁니다 5. 본인의 학번과 이름을 반드시 기재합니다 6. 미제출시 0점 처리합니다 * 기타 수업 및 레포트 관련 문의는 Biochemlee@google.com (S404호, 이종석, 010-8349-4947) 경량, 내열 (파괴인성 크리프 강도(피로강도))