2018-2학기 생명과학실험기법 Reverse transcription PCR & Real-Time PCR

Cell culture Seeding Treatment RNA extraction cDNA synthesis Real-time PCR

2. Concentration measurement 1. RNA extraction 2. Concentration measurement cell

3. cDNA synthesis 1. 역전사효소 (reverse transcriptase) 2. 5X reaction buffer (dNTPs, Mg2+ …) 3. RNA 4. Nuclease free water(to 20μl) cDNA 합성 Kit

4. real-time PCR PCR의 원리 Real-time PCR의 증폭곡선

4. real-time PCR 증폭이 시작되는 지점 (표준곡선) 미지의 시료의 Ct값으로 상대적인 mRNA의 농도를 측정함

< < Real Time PCR Method (SYBR green vs TaqMan) TaqMan TaqMan requires a sequence-specific probe that connects fluorophore and quencher SYBR Green 1 fluoresces only when bound to dsDNA specificity < expense Quencher < DNA polymerase의 exonuclease 기능에 의해 TaqMan probe로부터 flurophore가 분리되어 발광함

iScript reverse transcriptase Method cDNA synthesis ea Total 5X iScript reaction 4 ul 16 iScript reverse transcriptase 1 ul 4 DW 6ul 24 E-tube에 mixture를 만든다. Pcr tube에 RNA, mixture, and DW를 넣어준다. PCR machine 으로 cDNA합성 1) Priming 5min at 25’C 2) Reverse Transcription 20min at 46’C 3) RT inactivation 1min at 95’C 4) Optional step Hold at 4’C cDNA 1/10 dilution : RNA 1μg로부터 동량의 cDNA가 합성되었다고 가정하면, 합성된 총 cDNA는 1μg/20μL = 50ng/μL 이후 real-time PCR에 사용되는 cDNA template는 20ng 사용함. (합성된 cDNA 20 uL + 180 uL nuclease-free water = 200 uL) AML-12 ng/ul Average 1000ng->?ul DW Total Control 9 Compound-1 Compound -2

Method Real-time PCR Primer(Target gene) Primer(Reference Gene ) DNA 4ul 2XSYBR 10ul 40 Primer (Forward) 0.2ul 0.8 Primer(reverse) DW 5.6ul 22.4 Total(ul) 20 80 96 well PCR plate의 정해진 위치에 cDNA 4ul 씩 loading Mixture (primer, DDW, SYBR Green) 16ul loading Centrifuge 1000 rpm, 2 min Real time PCR machine 에 넣고 작동시킨다. Primer(Target gene) Primer(Reference Gene ) Primer :β-actin Primer : PPARα

대조군 시료에 비해 실험군 시료에서 유전자 X의 발현이 8배 증가한 것으로 측정됨. Result Ex) Ct 값 Target gene (Gene X) Reference Gene (β-actin) Control (대조군) 24 19 WY14643 (실험군) 22 20 Ct 값 dCt (Target – Ref) Control (대조군) 24 – 19 = 5 WY14643 (실험군) 22 – 20 = 2 [실험결과] 대조군 시료에 비해 실험군 시료에서 유전자 X의 발현이 8배 증가한 것으로 측정됨. Ct 값 ddCt Control (대조군) 5 – 5 = 0 WY14643 (실험군) 2 – 5 = -3 상대비율 2^ (-ddCt ) Control (대조군) 2^(-0) = 1 WY14643 (실험군) 2^(3) = 8

Result Ex) Relative mRNA level

→11월 15일 17:00 까지 바이오나노대학 507호 앞 박스로 제출 Discussion Q1. 결과값을 통해서 실험에 사용한 compound가 유전자 X의 발현에 미친 영향에 대하여 서술하시오. Q2. A와 B사이의 Gene Y 발현량 계산하여 비교 분석하시오. Ct 값 Target gene (Gene Y) Reference Gene (β-actin) A (대조군) 25 18 B (실험군) 23 19 Report →11월 15일 17:00 까지 바이오나노대학 507호 앞 박스로 제출