KNU Microbial Biotechnology Laboratory 식품미생물학 (Food Microbiology) KNUmbl 14장. 식품미생물의 검사법 경북대학교 식품공학과 교 수 박 희 동 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

목 차 14.1 미생물의 취급법 14.2 식품미생물 검사의 일반법 목 차 14.1 미생물의 취급법 14.2 식품미생물 검사의 일반법

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 14.1 미생물의 취급법 미생물의 특성 분석 : 병원미생물, 위해미생물, 발효미생물 등 배양을 통하여 미생물 균체를 얻어 분석 미생물의 순수배양 : 다른 미생물 혼입 방지 취급에 기술이 필요함 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 1. 무균조작 가. 미생물 배양 시 일반적 주요사항: 오염(contamination)에 주의 - 목적미생물만 순수하게 배양하면서 연구 1) 멸균(살균, sterilization) 철저: 실험기구, 배지 2) 무균조작: 접종, 미생물의 취급 시 무균실험대(clean bench)에서 시행 나. 멸균방법 1) 건열멸균: 160℃ × 1-1.5시간--건열멸균기(drying oven) - 기구와 면전(면마개--원면 사용)의 살균 2) 습열멸균: 주로 배지의 살균 가) 고압멸균=가압멸균: 120-121℃ (1.1 Kg/cm2 = 15 lb/in2) × 15-20 min, - 고압멸균기 사용(autoclave) 나) 간헐멸균(Tyndallization): 100℃ × 30분 - 3일 반복 - 고압멸균으로 분해 되기 쉬운 성분 3) 무균여과: 가열할 수 없는 배지—filter로 여과 0.22, 0.45㎛(pore size) - virus 여과불가능 4) 화학멸균: ethylene oxide: 10.7℃ 비등(최종농도 0.5-1%)--독성, 폭발 위험 5) 화염멸균: 접종기구 등 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 2. 배지 * 배지(배양기, medium) : 미생물의 배양을 위한 영양분의 혼합물 가. 영양원 1) 탄소원(carbon source): 세포의 탄소골격 - 대부분이 유기물--탄수화물 특히 단당류 주 2) 질소원(nitrogen source): 아미노산, (NH4)2SO4, (NH2)2CO 3) 무기원(inorganic salts): Ca, Mg, K, ---: 세포 내 합성불가 4) 생육인자(growth factor): 생육에 필수적인 데 세포가 합성하지 못하는 것 - 아미노산, 비타민, 염기의 어떤 것--배지에 첨가해 주어야 함 나. pH : 일반적으로 효모, 곰팡이는 pH 5-7, 세균과 방선균은 pH 7-7.5 다. 배지의 종류 1) 합성배지: 조성이 분명한 화학약품으로 만든 배지 2) 천연배지: 천연물을 사용하여 만든 배지-감자즙, 맥아즙, 탈지유, 혈액, 계란 등 3) 반합성배지: 합성배지와 천연배지의 중간 * 배지의 상태에 따라: 고체배지(solid media-고화제 첨가), 액체배지(liquid media) : 고화제- agar(한천) 1.5-2% 사용 – 고온에서 액체, 저온에서 고체 라. 대표적인 배지 1) 곰팡이: Czapek 배지, 감자즙포도당배지, 국즙배지(코지즙배지) 2) 효모: yeast extract 배지, 맥아즙배지 3) 세균: 영양배지(nutrient medium), 육즙배지(bouillon medium) 4) 방선균: yeast extract 배지 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory - 대표적인 배지들 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 3. 미생물의 접종 * 접종(inoculation) 접종기구: 백금이, 구, 선(백금 또는 니크롬선 가능) --화염멸균--종균을 소량 취하여 새 배지에 접종 1) 고체배지 사면배양: 한천사면배지에 직선 또는 획선 천자배양: 한천배지에 백금선의 끝으로 찔러 접종--통성혐기성균(유산균등) 2) 액체배지: 백금이에 균을 취하여 액체배지에 현탁 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 4. 미생물의 배양방법 가. 배양방법 1) 정치배양(stationary culture)--배지에 균 접종 후 정치하여 배양 2) 진탕배양(shakingcultue)--왕복 또는 회전진탕 배양기 사용 3) 교반배양--발효조에 무균공기 공급 동시에 교반--jar fermentor * 혐기성균의 배양 - 데시케이터--진공 또는 다른 기체로 치환하여 배양 - pyrogallol--알칼리 수용액에서 산소를 흡수 나. 배양온도 효모, 곰팡이: 25-30℃; 세균: 37℃; 방선균: 27℃가 적합 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 5. 미생물의 증식도 측정 * 증식, 번식(propagation): 세포성분의 일률적 증가 즉 세포량(cell mass)의 증가 --세포가 일정한 화학조성을 가짐 단세포 경우: 세균, 보통의 효모--세포수가 기준 균사상 경우: 곰팡이, 방선균, 균사상 효모--세포량 또는 특정 세포성분 가. 미생물량의 측정 1) 건조균체량 : 배양액 일정량 - 집균-물 세척-건조 (100-105℃) - 주로 곰팡이, 방선균 2) 미생물 세포 성분 측정 - 균체 질소량, 단백질량, ATP 양, 염록소 a 함량(조류) 3) Packed cell volume : 원심분리 침전량 : swing rotor로 원심분리--눈금이 있는 원심분리관에 균체의 부피 구함 4) 비탁법(turbidimetry): 균에 의한 빛의 산란--통과 빛의 강도 약화 차이 측정 - 비탁계(turbidometer)로 측정: 단위 Klett unit 5) 비색법(colorimetry): 균에 의한 빛의 흡수--흡광도(optical density) 측정 - 분광광도계(spectrophptometer)로 측정: 보통 600, 660nm 이용 - OD600 or OD660 으로 표시--단위 무 * 흡광도와 건조균체량의 무게는 특정 범위에서는 비례적 6) 습윤균체량: 배양액을 여과 또는 원심분리--무게 측정 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 나. 미생물 수의 측정 1) 계수반(counting chamber) 법 : 총균수 (Total count) 측정 - Thoma의 혈구계수기(haemocytometer) 이용하여 현미경에서 직접 계수 * 슬라이드 글라스에 분획 표시 분획 1칸: 0.05 mm × 0.05 mm × 0.1 mm = 0.00025 mm3 = 2.5 × 10-7 ml * 실험 예 : 시료 희석--혈구계수기에 시료 주 입--위에 cover glass --현미경에서 1칸 속의 균수 계수- 수회 반 복하여 1칸 속의 평균 세포 수 구함 * 계산: 1칸의 평균 세포수 × 희석배수 / (2.5 × 10-7 ml) = -- celll/ml로 환산 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 2) 입자계측기법 : 감압에 의해 세포현탁액을 미세구멍 통과시키면서 전기적 저항 측정 - 세포 수와 세포 용적으로 환산 3) Colony 계수법 : 생균수(Viable count, cfu/ml) 측정 * colony forming unit *plate counting method : 시료를 희석하여 혼합평판배양법으로 배양 --콜로니 계수한 후 희석배수 곱하여 생균수로 나타냄 --plate당 50-200 cfu 되게 배양하여 계수 --생균수 많으면: 단계 희석하여 일정량을 액상의 고체배지와 혼합하여 배양 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 4) 최확수법(MPN 법 - Most probable number method) - 통계적 방법에 따라 균수 추정하는 방법 - 각각 5개의 배지에 희석시료 0.1, 1, 10 ml 씩 접종하여 배양 - 총 15개 - 생육한 배지의 수로부터 균수 추정 - ---개/ml로 표시 ***최확수표 : ..\최확수표.ppt 5) Membrane filter법 : 생균수가 너무 적을 경우 살균 membrane filter로 시료 여과한 후 고체배지에 얹어 배양 - 콜로니 계수 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 14.2 식품미생물 검사의 일반법 * 식품의 미생물 기준 : 주로 세균과 대장균 기준 - 일반 세균 농도 : 신선도 추정 - 지표 미생물 검출 : 질병 위험 추정 – 일반적으로 대장균군 시험 * 주요 식품의 미생물 기준 식품 종류 세균 수 (cell/ml or g) - 평판법 대장균군 (cell/ml or g) 아이스크림 10만 이하 10 이하 시유, 강화우유, 크림 4만 이하 얼음 100 이하 음성 멸균시유, 마요네즈, 케첩, 식육제품, 어육연제품, 통조림류 등 젖산균 음료 10 6 이상 (유산균수) 발효유 10 7 이상 (유산균수 또는 효모수) 농후 발효유 10 8 이상 (유산균수) 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 1. 일반세균수 * 일반적 주의사항 1) 무균적 검체 채취--살균 용기, 살균 도구 사용 2) 식품 상태와 유사한 조건 유지--냉장식품의 경우 낮은 온도에서 운반 및 보관 3) 검체는 전체를 대표 가능한 최소량 채취 * 일반세균수 (표준평판법) 측정 : 생균수 : 호기성 및 통성 혐기성 생균수--식품의 신선도 추정 가능 - 표준한천배지 (plate count agar, standard method agar) : 0.5% tryptone, 0.25% yeast extract, 0.1% dextrose, 1.5% agar (pH 7.0) - 희석시료 도말 후 35 ℃에서 24-48시간 배양 (시료에 따라서 72시간 배양) - 100 cfu/ml 이하 신선, 100만 이상 오염 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 2. 대장균 검사법 : 정성시험 * 대장균 검사법 – 정성시험 : 대장균군 존재 여부 결정 : 대장균검사법: 젖당부이욘법, deoxycholate법, BGLB(brilliant lactose bile 법) : 배양조건: 액체배지-35±1℃, 48±3 시간, 고체배지-35±1℃, 24±2 시간 배양 * 젖당부이욘법(lactose broth법)에 의한 대장균 정성시험 -추정, 확정, 완전시험 1) 추정시험 : 대장균군 오염여부 추정--젖당 분해에 의한 가스 발생 확인 -시험관에 젖당부이욘 배지 및 Durham tube(듀람 관) 넣고 살균 -냉각 후 검체 첨가 (10ml, 1ml, 0.1ml 씩 각 2개) * 10ml 첨가 시 2X or 3X 배지사용 -배양 후 가스발생 시 추정시험 양성 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 2) 확정시험 : 대장균군 오염여부 확정-젖당으로부터 산 생성 확인하여 양성 결정 EMB 또는 Endo 한천 배지에 배양액 획선도말 배양 후 콜로니 색 확인 EMB 배지: 녹색 금속광택 콜로니, Endo 배지: 분홍배지에 선홍색 콜로니 3) 완전시험 : 젖당 분해에 의한 가스 발생 재확인, 그람음성 무포자 간균 확인 -젖당 부이욘 배지에 배양 가스발생 재확인--추정시험과 동일하게 -영양 한천 배지에 배양 후 그람음성 무포자 간균 확인--대장균군 양성 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory

KNU Microbial Biotechnology Laboratory 3. 대장균 정량시험 * 대장균 정량시험: 젖당 부이욘 또는 BGLB 배지 사용하여 MPN 결정 액체배지 15개에 검체 10, l, 0.1ml를 각각 5개 씩 접종 - 각각의 경우 가스 발생 수에 따라 최확수(MPN) 결정--최확수 표 - MPN(most probable number) : 개/100g로 표시 2019-01-17 KNU Microbial Biotechnology Laboratory