2008. 7. 16 김치 유산균의 분리 동정 미생물과 송 병 준 자연과 생명이 살아 숨쉬는 땅 전남

목 차 1. 김치의 특성 2. 유산균의 분리 동정 3. 결과 4. 유산균의 특성 5. 연구동향

김치의 특성 우리나라의 고유의 발효식품으로 주원료와 부원료 향신료를 첨가하여 발효시킨 채소 발효식품이며 식이섬유, 비타민, 무기질등을 공급해주는 우수한 식품 미생물에 의한 복합 발효로 숙성되어지며 재료 중의 탄수화물, 아미노산, 등으로 부터 산미, 지미, 방향을 내는 저분자 물질들이 생김으로 독특한 맛과 향을 주게 됨

김치 발효 과정 발효초기 Gram 음성균 Aeromonas 속과 Gram양성균인 Bacillus속이 우점종으로 나타남 말기에는 유산을 기질로하는 효모가 증식하여 pH를 상승시키고 균체가 분비하는 pectin 분해 효소에 의해서 연부 현상이 나타남

Culture medium 1. BCP첨가 평판측정용 한천배지 - 유산균 음료 중의 유산균 측정용 - BCP(bromocresol purple) 0.004~0.006% pH 5.2: 노랑, pH 6.8:보라색 , 황색 집락을 유산균 집락을 계측 - 배지주성분: yeast extract , peptone, agar 2. BPB 첨가 평판측정용 MRS배지 - BPB(bromophenol blue) 0.002%, pH 3.0:노랑, pH 4.6 : 보 라색 - 유산균 배양에 널리 이용 - 배지주성분: Glucose, beef extract, yeast extract , petone 3. CaCo3 첨가 평판측정용 MRS 배지 - 0.5% CaCo3 첨가, 유산균 주위의 투명한 막 형성 KTCC (한국 미생물보존센터, Korea Type Culture Collection)에서 분양

유산균종의 확인 평판에 발생한 집락의 색과 크기 , 형태, 집락 주변의 배지 색상의 차이 유산균종 의 존재여부 확인 배지 색상의 차이 유산균종 의 존재여부 확인 - Stereptococcus faecalis : 유산을 많이 생성 백색의 집락이 형성 - Leuconostoc mesenteroides : 유산 생성이 적어 색상 전체가 암청색으로 환이 없고 집락의 크기가 적게 나타남 - Pediocococcus acidilactici : 암청색(pH영향, 균주의 수명 짧다) 집락 계수 대상 평판 - 평판 1개당 30~300개의 집락을 발생한 평판을 택하여 집락수 를 계측하는 것을 원칙

젓산균의 분리 재료 및 방법 1. 재료 배추김치와 묵은지 2. 유산균 분리 - 시료 10g 取 멸균수 90㎖ 加 혼합 마쇄     - 현탁액 1㎖를 9㎖증류수에 희석     - 105 - 106 CFU/㎖의 농도로 단계희석     - 0.5% CaCO3(w/v)가 들어간 MRS 고체배지에 분주     (CaCO3 5g/L, MRS agar 68.2g/L 50-60℃)     - 30℃에서 2일 배양 CaCO3에 대한 투명환 형성한 콜로니를 분리     - 분리된 균주는 MRS 액체배지에 배양   

젓산균의 동정 - 18-24시간 배양 후 배양액 0.5㎖ + 25% glycerol(v/v) 0.5㎖ stock  에 -70℃에 본관, 3. 형태 및 생물학적 특성    - MRS 액체배지에 한 콜로니를 접종 30℃에서 24시간 배양    - 배양액 1㎖을 취하여 11,600×g에서 1분 원심분리    - 균체와 상징액 분리    - 균체는 catalase 시험, Gram 염색(보라색) 후 현미경 관찰     형태와 염색결과를 확인   상징액은 pH 측정    ※ catalase 시험 : 거품이 생기면(+) 유산균이 아님, 안생기면(-) 유산균 ( 슬라이드 상에 Gram, catalase 시험을 병행)

실험결과 - 희석 : 10-5 - 실험균주 MRS 액체배지 종균 : 31 - pH 측정결과 : 4.3(담근직후 pH 5.6) - Catalase test : 31종 음성 Gram 염색 결과 : Gram 양성 간균 API : 3종 확인(Lactococcus lactis ssp lactis 1, Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii) - pH 4.0과 5.0사이의 김치 L. mesenteroids, Leuconostoc citreum, L. plantarum, Lactobacillus faciminis 검출 - 김치의 맛이 가장 좋은 적수기(pH 4.2, 산도 0.6~0.8) (도달 기간 :30℃ 1~2일, 20 ℃ 3~4일, 5℃ 20~30일 소요) 원료의 종류, 처리방법, 고형분의 비 등에 약간의 차이

김치 평판배지 10-3 10-4 곰팡이균 10-5

김치 Gram 양성 간균 Gram 양성 간균

API Test Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii Lactococcus lactis ssp lactis 1,

김치 묵은지 효모 –Saccharomyces servazzii

유산균의 특성 김치로 부터 분리 동정 미생물 유산균 포함 200여종 - Leu. Mesenteroides . 발효초기 주 발효균으로 김치환경을 산성화 혐기성상태로 만듬 . 김치의 맛과 풍미 좋게, 잡균인 호기성 세균의 번식을 억제 Lactobacillus plantarum : 발효후기에 김치내 번식된 미생물에 서 유래된 효소가 활성화하여 왕성하게 번식 산패시 최고 의 성장을 보이는 균 - Pichia membrananefaciens : 발효말기에 공기와 접촉하는 김치 표면에 산막을 형성하여 김치의 부패를 촉진시키는 산막효모 - Escherichia coli : 김치의 산업화에 따른 대량생산 유통과정의 다양화로 식품 오염균으로 문제시 되는 균

연구동향(보존력) 유통과정 중 과다숙성을 억제하고 상품김치의 신선함 유지할 수 있는 방법 모색 - 김치에는 보존료 허용 규제 있는 방법 모색 - 김치에는 보존료 허용 규제 - 한약재, 향신료 등 천연식물 이용 미생물 증식 억제 물질 탐색 연구 자초, 황백 추출물 첨가 pH의 저하, 산도, 유산균수 및 총균수의 증가를 효과적으로 억제하여 숙성 지연효과 부추의 추출물이 김치의 중기 숙성균인 Pediococus cerevisiae 와 산 생성 능력이 강하 L. plantarum의 증식 억제능력 - 소나무 에탄올 추출물 첨가에 의한 김치의 숙성이 억제효과 - 유기산인 아디프산을 이용 미생물 생육 억제효과 글루코노델타락톤 : 초기 주 발효균 Leu. Mesenteroides, L.plantarum 생육을 억제 산도의 증가를 지연시켜 김치 조직의 연화를 방지

연구동향(생리활성) 생리활성 측면 연구 - 항유전 독성효과 - 활성산소에 의한 김치의 세포독성 완화효과 - 혈전용해 효소를 생산하는 미생물을 분리 Bacillus amyloiquefaciens, Bacillus brevis, Micrococcus luteus - 체중증가율, 식이섬유, 혈중 중성지방량, 혈중 총 cholesterol 저하

연구동향(박테리오신) 항균 활성을 가지고 있는 천연 항생 물질로서 gram양성균과 gram 음성균 의 생육에 영향을 미치는 단백질성 항생물질 - Lactobacillus acidophilus : 장내 정상 균총을 안정화 ,장 질환 예방 Leu. Citrum GJ7 : 우수한 발효능, 박테리오 생성능 및 박테리오신 생성 유도작용 보유능을 동시에 갖춘 김치발효 우량 종균 - Pediococcus pentosaceus MD1: H.pyroli 억제능 Lactobacillus sakei P3-1 : 식중독을 일으키는 Listeria monocytogenes 의 성장을 효과적으로 저해하는 유산균 Leuconostoc kimchii : Exopolysaccharide 생성 유산균(내산성에 강함) Lactobacillus sp : 위생미생물 살균효과

향후 연구계획 감사합니다.