단백질의 정량 -Bradford 법 2017.05.24
Central dogma
Protein structure Protein structure Primary structure - amino acid chain Secondary structure - a-helix , b-Sheet Tertiary structure - domain Quaternary structure - subunit
Principles of Bradford assay - Spectrophotometer를 이용, 흡광도를 측정하여 standard물질인 BSA(Bovine Serum Albumin)을 기준으로 자신의 시료에 단백질이 얼마만큼 들어있는지 측 정하는 것 Bradford 방법은 미량 정량 (microassay)을 사용하면 ~20mg의 단백질량 까지 측정할 수 있다. Bradford 방법은 빠를 뿐만 아니라 비단백질 성분들에 의 한 방해도 거의 없다.
Bradford method Free dye Bound dye (Cationic) (Anionic) 450 nm 590 nm Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250이 특정 아미노산과 결합시의 흡광도의 변화를 측정하는 방법. Arg, Lys – Electrostatic attraction Trp, Tyr, Phe, His - Hydrophobic interaction CBBG가 free dye의 형태로 있을 때 최대 흡광 파장은 450 nm (red) 이지만, amino acid와 결합하여 anionic form일 때의 최대 흡광은 590 nm (blue) 인 특징을 이용. Free dye (Cationic) 450 nm Bound dye (Anionic) 590 nm
Bradford method Bradford method의 장점 - 빠르고(10 분), 저렴 - 생체고분자 물질 중 단백질에 매우 특이적 (비단백질 성분들에 의한 방해도 거의 없음) - 높은 sensitivity (1~20ug) dye-complex는 약 1시간 동안 안정 Bradford method의 단점 각 단백질의 아미노산 조성에 따라 반응 정도가 달라짐. 따라서 standard의 선택이 중요함. - detergent (Triton X -100, SDS), 강염기 등에 의해 방해 받을 수 있음 (dye로 사용하는 Coomassie blue가 acidic하기 때문). - 일반적으로 3000Da 미만의 단백질은 Bradford assay로 정량을 신뢰하기 어려움
- Spectrophotometer - 원리
Materials 1. BSA (bovine serum albumin) 청에 녹아있는 단백질의 한 종류 - 이 단백질을 정제해서 용액속에 녹인 것이 BSA 용액으로 보통 단백질의 농 도를 알고 싶을 때 standard 로 사용
Bradford solution(마지막) Methods ① Bradford solution, D.W 그리고 BSA을 밑의 표와 같이 섞어 준다. BSA농도 0.625 1.25 2.5 5 10 20 BSA 400씩 2 D.W 400 998 Bradford solution(마지막) 100 200ul 버림 Total volume: 500ul ② 5분 정도 equilibrium을 시킨 후, spectrophotometer을 이용해서 O.D 값을 측정한다. (200ul씩 2군데 분주해서 평균값 사용) ③ 측정 값을 이용해서 standard curve을 그리고 우리가 측정하고자 하는 미지 시료의 값을 대입하여 protein양을 측정한다.
Results