유세포분석법 (Flow cytometry)

측정하고자 하는 입자나 세포를 하나 하나씩 흐르는 유액 상태 에서 광원으로 쓰여 지는 특정한 Laser와 부딪쳐서 발생하는 물리적인 현상(빛의 산란현상, 형광물질의 발광현상)을 이용하 여 세포에 관련된 여러 가지 정보를 측정하는 기기 유액 상태의 입자나 세포가 일정 감지지역(sensing poin t)을통과할 때 각각의 입자나 세포를 신속하게 측정하여 하나의 세포가 갖는 여러 특징(세포의 크기, 세포 내부 조 성정도, 세포기능등)을 동시에 측정하고, 경우에 따라 특 정한 세포들만을 선택하여 분리(sorting)할 수 있는 장비 세포를 기반으로 한 연구에 있어 기본적인 분석 장비

Cytometer system

Fluidic system(유체계): - 세포나 입자를 일정한 지역까지 정확하게 이동 시킴 - 이동하는 동안 어떤 물리적인 영향도 받지 않도록 보호하는 역할 Optic system(광학계): - 빛 신호를 발생시키고 수집하는 시스템 - 강한 강도로써 일정한 파장을 만드는 에너지원으로 Laser beam을 사용 Electronic system(전기계): - 발광된 빛 신호를 전기적 신호로 전환한 후, 디지털 신호화하여 컴퓨터로 보여주는 시스템

1. Fluidic system Flow stream을 통해 세포 또는 입자들을 sheath 용액 안으로 이동시키고, laser 를 만나는 flow cell을 거쳐 waste까지 운반

그림 20-8. 유체실(flow cell) 내의 결흐름(lamina flow) 원리 모식도

2. Optic system Excitation laser와 emission된 빛을 흡수할 수 있는 다양한 구성요소로 이루어진 시스템 Emission Excitation Optical filters

이색거울(dichroic mirror): 사선각도로 설치되어 특정 파장의 빛은 통과시키고 이외의 파장의 빛은 반사

Side scattered light: SSC Forward scattered light: FSC

Excitation laser Band pass filter

3. Electronic system 방출된 빛을 전기적 신호로 전환 디지털신호 결과 로 전환 Dot plot Histogram Contour plot

표 20-1. FCM에서 사용되는 주요 형광염료

결과 분석- Dot plot & Histogram CD4/CD8 double staining CD4-PE CD8-FITC Cell count CD8-FITC CD4-PE

결과 분석- Linear & log scale ex) CD4 staining Linear로 결과를 표시하면 negative와 positive 구분이 어려움 ex) cell cycle Log scale로 결과를 표시하면 샘플간 결과의 차이를 간과할 수 있음

결과 분석- Gating 획득한 세포 중에서 실험 목적에 맞게 특정세포만을 선택 Step 1 Step 2 Step 3 Parent = All event Step 2 Parent = lymphocyte Step 3 Parent = CD3+ lymphocyte FSC/SSC: lymphocyte gate CD3+ lymphocyte gate CD3+ lymphocyte 중 CD4+ and/or CD8+ T cell 분석

표 20-2. FCM의 임상적 응용

기존의 면역 형광현미경 검색이나 면역효소 염색법에 비하여 민감도 (sensitivity)와 정확도(specificity) 월등 장점 기존의 면역 형광현미경 검색이나 면역효소 염색법에 비하여 민감도 (sensitivity)와 정확도(specificity) 월등 질병의 기능적 상태를 측정하고 질병의 추이를 관찰에 유용 염색 과정이 매우 간단하여 검사가 신속하고 많은 항원 등에 대한 검사를 동시에 실시 결과가 숫자로 표현되어 객관성 있게 재현

단점 부유액 상태로 만들어야만 검색을 할 수가 있음  조직의 구조에 대한 정보를 얻을 수 없다. 검체의 부피가 적거나 섬유화 또는 괴사가 심할 경우  세포 획득에 지장을 초래 할 수 있다. 적은 부위에만 종양이 국한된 경우  종양 세포의 특징이 간과될 우려가 있다.

전자현미경검사

전자를 발생시켜 형성한 전자선을 시료에 조사하고 전자신호를 관찰 고배율, 고해상도로 시료를 관찰 그림 21-1. 광학현미경(왼쪽)과 전자현미경(오른쪽)의 비교 모식도

투과전자현미경 (transmission electron microscope, TEM) 필라멘트(주로 텅스텐)에서 방출되는 전자선(electron beam)이 시료를 투과하여 이미지를 형성 전자선의 진행을 위하여 진공이 유지되어야 하고 진공 조건에서 생물시료는 변형이 발생하므로 별도의 시료 전처리가 필요 전자선이 시료를 투과하기 위하여 일반적으로 시료는 인체 모발 두께의 1/2,000에 해당하는 50~60 nm 수준으로 얇게 절단 세균이나 바이러스와 같은 시료는 두께가 얇으므로 중금속 염색 을 통하여 직접 관찰하여 외관 및 부속 구조물을 관찰

생물시료 처리법-투과전자현미경 절취: 1mm3이하 전 고정: 2.5% glutaldehyde, 4℃에서 반응 후 고정: 1% osmium tetraoxide, 4℃에서 반응 3) 탈수: 상승계열알코올 (50%==100%) 4) 치환: 산화프로필렌 (propylene oxide)

생물시료 처리법-투과전자현미경 5) 포매: 주로 비수용성 에폭시 수지(epoxy resrin) - 수분을 다량 함유한 생물 시료의 내부를 관찰하고자 할 경우, 포매하여 중합(60 ℃ 가열)반응 6)) 박절: 열 또는 자외선으로 중합시킨 플라스틱 블록을 유리 및 다이아몬드칼로 절단(60-90 nm)하여 절편을 제작 그리드(grid)에 올려놓음 중금속(초산우라닐 & 구연산납)으로 염색

유리칼과 다이아몬드 칼

그리드 (Grid) 초박절된 절편을 올려놓는 것 여러 개의 작은 구멍이 있는 3 mm정도의 얇은 원형의 금속판

절편의 두께: 절편의 색깔을 보고 판정60~90 nm 두께는 은색

그림 21-2. 투과전자현미경 표본제작과정 흐름도.

주사전자현미경 (scanning electron microscope, SEM) 전자선이 시료와 반응하고 반사된 전자(이차전자)를 포획하여 이미지를 형성 전자선을 집속하여 미세한 점광원(probe)으로 형성한 후 시료 표면을 주사 진공이 유지 생물 시료와 같이 부도체인 시료는 전기전도성을 부여하기 위하여 금이나 백금으로 코팅하여 관찰

생물시료 처리법-주사전자현미경 시료를 절취하여 고정, 탈수, 건조 과정을 거침. 시료대(stub)에 양면테이프 등을 이용하여 올려놓음. 주로 금(Au) 또는 백금(Pt)으로 이온코팅하여 시료에 전기전도성 부여 4) 시료의 입체적인 구조를 관찰

검체재물대(stub)

위점막표면

Real time PCR

각 PCR 단계에서 증폭산물의 fluorescence를 측정

Ct : Threshold Cycle (증폭이 시작되는 Cycle) Rn : Reporter dye의 signal 수치

DNA-binding fluorescent dye SYBR Green등 Double strand DNA minor groove에 결합하여 형광을 발함 PCR이 수행되어 지면서 증폭되는 산물에 결합하여 내는 형광으로 측정 장점: 적용이 쉽고 저렴하게 사용 가능 단점: 모든 dsDNA에 결합(primer dimer, nonspecific product) Target product의 증폭 유무 확인 필요

Probe based dye TaqMan probes등 목적 DNA 염기서열에 결합 두 가지 형광 dye 결합 - 5’말단-R: reporter dye - 3’말단-Q: quencher dye Taq polymerase(5’ exonuclease activity)에 의해 probe가 분해 시 Reporter(5’) 와 quencher(3’)가 분리되어 reporter에 의해 fluorescence가 발생