제 12장 동물세포 배양시의 생물공정에 대한 고찰 - 광범위한 종류의 치료용 단백질 생산 숙주 - posttranslational modification 12.1 동물세포의 구조와 생화학 - 크기 10 - 30 ㎛의 원형 또는 타원형 - 미세융모 (microvilli) : 세포의 표면적 증가로 물질 수송에 유리 - Anchorage dependent cells : 세포의 표면은 음전기를 띠어 sephadex나 collagen 같은 양전기를 띤 표면에 부착하여 자라는 성질 : 특이한 세포표면 수용체를 지닌 것도 있음 <---> hybridoma는 현탁배양에서 성장 - 소포체, 미토콘드리아, lysosome, 골지체, 핵, microfilament - 배양배지 : 포도당, 글루타민(탄소원과 에너지원), 아미노산, 혈청(5-20%), 무기염류 - 해당과정 ( pentose phosphate pathway포함) -> TCA회로 (그림 15.2) 젖산염과 암모니아가 유출됨 --> 고농도 배양시 문제점
12.2 동물세포배양에 사용되는 방법들 - T flask에서 1차 배양세포를 형성, 일반적으로 aggregate를 형성하지 않고 표면 에 단일층으로 생장 --> EDTA, trypsin, collagenase, pronase등으로 단일세포로 분리가능 - 2차 배양세포 : 1차 배양세포로부터 얻어진 cell line, 현탁배양이 가능 - 사멸성 : 대부분의 분화되는 포유동물세포들 (WI38, MRC-5 (인간 섬유아세포, 30 세대)) <---> 불명성 : 암세포 - 곤충세포배양 : baculovirus로 유용 단백질을 생산 --> 전체 단백질의 40%생산 : 자연적으로 불멸성 - hybridoma : lymphocyte (항체를 만드는 혈액세포) + 골수종(myeloma) : 불멸성이고 특히한 항체를 연속적으로 대량생산가능 - Chinese hamster ovary (CHO) cell : 항체이외의 재조합 단백질 생산 : virus유래의 vector를 사용
12.2 동물세포배양에 사용되는 방법들 - 혈청 : 호르몬과 생장인자, 세포부착증대, 수송단백질 제공 (표 15.1) : 고가 ($100-500/L)이명 바이러스와 마이코프라즈마의 오염 : 무혈청 또는 저혈청 배지의 개발 (표 15.2) --> 배지가격축소 --> 분리정제공정간편화 --> 결과의 재현성, 오염감소 - 포유동물세포배양 : 37℃, pH 7.3, 5% 이산화탄소 보강된 공기 사용 (pH 완충역활) : carbonate buffer (중탄산염 사용, 이산화탄소가 보충) : 약한 공기공급과 교반 - 곤충세포배양 : 28 ℃, pH 6.2 - 정지기가 짧음, 생산물은 mixed growth associated (그림 15.4) - doubling time : 10 - 50시간 - 산소요구량은 작음 (식물세포배양의 1/5배) - 전단응력에 매우 예민
12.3 동물세포배양을 위한 생물반응기의 고찰 - 동물세포 : 크기가 크고 생장속도는 느리며, 전단응력에 민감 - 일반적인 특징 : i) 약한 교반과 공기공급 (sail-type agitator) ii) 잘 제어된 외부환경 ( 온도, pH, DO, 산화환원전위, 이산화탄소) iii) 부착성 세포의 경우 넓은 표면적 (roller bottle, microcarrier) iv) 젖산이나 암모늄의 제거와 생산물의 배양과정중 농축 (세포 고정화, holow-fiber reactor, membrane bioreactor사용) 12.4 동물세포배양의 생산물 - 단일군항체 : 치료 및 진단용, 100가지이상 개발 - 면역조절인자 : 인터페론, 인터루킨등 - 바이러스 백신 - 호르몬 : EPO - 효소 : 혈액응고인자등 - 살충제 : 특이적인 곤충 바이러스 생산 - 전체세포 및 조직배양 : 인공피부, 장기, 뼈등의 배양