공중 낙하균 및 표면균 검사 목적 근거 1) 공중낙하균 - 공기중에 미생물의 존재를 인지하기 위해 공중낙하균 검사법을 원리와 방법을 익힌다. 2) 표면균 - 작업자의 손, 작업장의 표면, 행주, 도마에 대한 미생물오염도를 검사하는 원리와 방법을 익힌다. 근거

공중 낙하균 및 표면균 검사 원리 □ 공중낙하균 - 작업장에서 공기중에 오염된 미생물이 많을 경우 낙하를 통하여 제품에 감염되기 때문에 제품의 품질을 떨어뜨리는 원인을 제공한다. - 따라서 작업환경을 청결히 유지하여야 한다. - HACCP인증 작업장이나 건강기능식품 GMP(fGMP), 화장품 cGMP나 의약품인 KGMP 작업장의 경우 각 기준을 준수하기 위해 정기적인 작업장 환경의 청결도를 측정하여 지속적인 개선이나 시설보완에 대한 기준을 설정하기 위해 공중낙하균시험을 실시한다.

공중 낙하균 및 표면균 검사 □ 손, 작업대 표면, 행주, 도마 등 - 작업장 환경 외에 중요한 위생관리 대상은 작업자의 손이나 의복, 작업대 표면, 행주, 도마 등의 청결 또한 매우 중요한 위생관리대상이다. - 따라서 각 환경의 청결도를 확인하기 위해 표면오염도를 정기적 으로 검사하여 관리기준을 설정할 때 중요한 지표로 이용된다. - 이러한 분석법을 통하여 ㆍ작업자의 손검사나 세척방법을 설정하고, ㆍ작업대 또는 기구의 청결에 대한 평가와 기준, ㆍ행주 및 도마의 세척 정도나 세척방법에 대한 평가나 기준을 설정하는 데 이용된다.

공중 낙하균 및 표면균 검사 준비물 - 배지 및 시액 : 멸균생리식염수, 멸균면봉 표준평판배지 (PCA) or 보통한천배지(Nutrient agar) 3M film (AC, EC, CC) 감자-덱스트로스 한천배지(PDA) - 장비 : 무균대, 고압멸균기, 피펫과 팁, 배양기, 시험관, 페트리접시

실험 수행할 장소(실험실, 강의실, 옥외, 크린벤치, 화장실 등)를 설정하고 위치를 설정한다. 공중 낙하균 및 표면균 검사 □ 낙하균 실험 30~50 cm 실험 수행할 장소(실험실, 강의실, 옥외, 크린벤치, 화장실 등)를 설정하고 위치를 설정한다. ↓ 배지(NA/PCA, 일반적 2~3매)의 뚜껑을 열고 15분 (또는 식품, 진균 20분)분간 방치 배양기에서 배양한다. (세균; 35 ℃에서 48시간, 진균 25℃에서 5-7일간) 콜로니를 계수한다.

공중 낙하균 및 표면균 검사 □ 손 세척전과 세척후 시료를 채취하여 실험수행 ↓ 면봉을 이용하여 정해진 면적을 채취한다. 3-5cm 공중 낙하균 및 표면균 검사 □ 손 3-5cm 세척전과 세척후 시료를 채취하여 실험수행 ↓ 면봉을 이용하여 정해진 면적을 채취한다. 9ml 생리식염수에 면봉을 첨가하고 균질화한다. (1분간 vortexing, 1회 더 반복) 10-3까지 희석한다(세척 손 10-2 ). 세균과 대장균/군은 3M film, 진균은 PDA를 이용하여 표준평판법으로 접종 배양기에서 배양한다 배양한다 (일반세균(대장균/군) 35℃에서 48시간(24시간), 진균 25℃에서 5일간) 콜로니를 계수한다.

공중 낙하균 및 표면균 검사 □ 행주 무균적으로 행주를 10x10cm(또는 5x5cm) 크기로 자른다, ↓ 스토마커 백에 100ml 생리식염수를 넣고 행주를 넣고 혼합한다 10-5까지 희석한다. 세균과 대장균/군은 3M film, 진균은 PDA를 이용하여 표준평판법으로 접종 배양기에서 배양한다 배양한다 (일반세균(대장균/군) 35℃에서 48시간(24시간), 진균 25℃에서 5일간) 콜로니를 계수한다.

공중 낙하균 및 표면균 검사 □ 도마/작업대 10cm Swab(면봉/가제)을 이용하여 도마나 작업대를 10x10 cm의 격자를 만든 후 검체를 채취한다. ↓ 9ml 생리식염수에 면봉을 첨가하고 균질화한다. (1분간 vortexing, 1회 더 반복) 10-3 또는 -5 까지 희석한다. 세균과 대장균/군은 3M film, 진균은 PDA를 이용하여 표준평판법으로 접종 배양기에서 배양한다 (일반세균(대장균/군) 36℃에서 48시간(24시간), 진균 25℃에서 5-7일간) 콜로니를 계수한다. 10cm

3. 일반세균(Bacterial count)  시험방법 1. 시료 25g + 225ml 생리식염수 ↓ 2. Stomching (약 1분) 3. 시험용액 1㎖을 취해 4. 희석을 수행 (10-1~10-4) ① ① ② ③ ④ ④

3. 일반세균(Bacterial count)  시험방법 5. 희석배수별로 petridish 2매에 에 라벨을 하고 무균적으로 취함 ↓ 6. 43~45℃의 표준한천배지 약 15㎖를 무균적으로 분주 7. petridish 뚜껑에 부착되지 않도록 주의하면서 조용히 회전 8. 검체와 배지가 잘 섞였으면 냉각 응고 9. 확산 집락 발생을 억제하기 위해 표준한천 배지를 3~5㎖ 가해 중첩 10. 냉각 응고된 petridish는 거꾸로 하여 35±1℃에서 48hr 배양(검체에 따라서는 35℃, 72±3hr) ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩

3. 일반세균(Bacterial count)  시험방법(건조필름법) 1. 희석시료준비까지는 동일 ↓ 2. 각 단계별 희석용액 1 mL을 세균수 건조필름배지 2장에 접종한다. 3. 누름판을 필름중앙에 놓고 살짝 누른다 (약 1분) * 주의 - 필름 바깥으로 용액이 흐르지 않도록 한다. 4. 35±1℃에서 48hr 배양한다. ③ ② ④

3. 일반세균(Bacterial count)  결과 1. 표준한천배지에 집락이 발생하면 집락수를 카운팅한다. 2. 카운팅은 15~300안의 숫자만 계산하고 전 평판에 15개 이하의 집락만 얻었을 경우에 가장 희석배수가 낮은 것을 측정한다. 3. 유효숫자는 2개이며 단위는 시료가 고체일 경우 CFU/g, 액체일 경우 CFU/mL이다.

3. 일반세균(Bacterial count)  결과 1. 건조필름에 적색의 집락을 카운팅한다. 2. 카운팅은 15~300안의 숫자만 계산하고 전 평판에 15개 이하의 집락만 얻었을 경우에 가장 희석배수가 낮은 것을 측정한다. 3. 유효숫자는 2개이며 단위는 시료가 고체일 경우 CFU/g, 액체일 경우 CFU/mL이다.

N = ΣC / < ( 1 × n1 ) + ( 0.1 × n2) > × (d) 3. 일반세균(Bacterial count)  결과 N = 식육 g 또는 ㎖당 세균 집락수 ΣC = 모든 평판에 계산된 집락수의 합 n1 = 첫 번째 희석수에서 계산된 평판수 n2 = 두번째 희석배수에서 계산된 평판수 d = 첫 번째 희석배수에서 계산된 평판의 희석배수 ① 15 - 250CFU/ plate 인 경우 N = ΣC / < ( 1 × n1 ) + ( 0.1 × n2) > × (d) 구 분 희 석 배 수 CFU/ g(㎖) 1:100 1:1,000 집 락 수 232 244 33 28 24,000 N = (232 + 244 + 33 + 28) / <(1×2) + (0.1×2)> × 10-2 = 537/0.022 = 24,409 = 24,000 ② 15 CFU / plate 이하인 경우 ③ 300 CFU /plate 이상인 경우 구 분 희 석 배 수 CFU/ g(㎖) 1:100 1:1,000 집 락 수 18 10 2 1 <2,500 구 분 희 석 배 수 EAPC/ g(㎖) 1:100 1:1,000 집 락 수 TNTC 630 650 640,000

4. 대장균군/대장균 (Coliform group/E. coli)  시험방법(건조필름법) 1. 희석시료준비까지는 동일 ↓ 2. 각 단계별 희석용액 1 mL을 세균수 건조필름배지 2장에 접종한다. 3. 누름판을 필름중앙에 놓고 살짝 누른다 (약 1분) * 주의 - 필름 바깥으로 용액이 흐르지 않도록 한다. 4. 35±1℃에서 24~48hr 배양한다. 5. 판정 : 건조필름 I은 가스가 발생한 붉은색 집락수를 계수한다. 건조필름 II는 청색 및 청녹색의 집락수를 계수한다.

5. 대장균(Escherichia coli) 정량실험 (건조필름법) 1. 희석시료준비까지는 동일 ↓ 2. 각 단계별 희석용액 1 mL을 대장균 건조필름배지 2장에 접종한다. 3. 누름판을 필름중앙에 놓고 살짝 누른다 (약 1분) 4. 35~37℃에서 48±2hr 배양한다. 5. 판정: 가스가 발생한 푸른색 집락수를 계수  희석배수 환산

공중 낙하균 및 표면균 검사  결과요약 항목 판정 비고 낙하균 일반세균 CFU/㎠ 또는 /9cmØ/hr 진균 CFU/㎠ *petridish 면적을 이용 손 세척 전 세균 CFU/㎠ (면적을 환산) 대장균/군 세척 후 도마/ 작업대/기구