질량분석기의 원리 (FAB, ESI, APCI 이온화법 및 Sector type 질량분석기의 원리 )

Schematic Diagram of Mass Spectrometer Inlet System Ion Source Mass Analyzer Print out Data Processor Detector Vacuum System Reservoir DIP GC LC EI CI FAB API ESI Magnetic Secter Quadrupole Ion trap TOF

SAMPLE ANALYSIS by MASS SPECTROMETRY SAMPLE vaporizable Single component Mixture Multiple component vaporizable DIP -EI -CI DIP -FAB -ESI MALDI GC/MS -EI -CI non- vaporizable LC collection LC/MS -ESI -APCI Vaporizable + non- vaporizable -FAB -ESI -MALDI vaporizable non- Y N Y N

Ionization modes NAMEYEARIONIZATION AGENT Electron Ionization (EI)1920Energetic Electrons Chemical Ionization (CI)1965Chemical Reagent Field Desorption (FD)1969High Electrode Potential Field Ionization (FI)1970High electrode Potential Plasma Desorption (PD) Cf Fission Fragment Secondary Ion Mass (SIMS)1977Secondary Ions Laser Desorption (LD)1978Laser Beam Thermal Desorption (TD)1978Heat Fast atom bombardment (FAB)1981Fast Atom Thermospray (TSP)1985Thermospray of Liquid Electrospray (ESI)1989Electro Potential Matrix-assisted Laser Desorption (MALDI) 1990Laser Beam

FAB(Fast Atom Bombardment) FAB 는 최소의 fragmentation 을 이용하는 soft ionization 기술 중 의 하나 극성이며 열에 민감한 시료에 적합하며 생물학적 고분자량 물질 의 연구에 중요한 이온 생성 법. 대부분의 질량분석기에 장착할 수 있지만 Sector type 질량분석 기에 적당 1nanomole 의 적은 양의 분석시료도 검출이 가능

FAB Ionization

FAB 의 이온화과정 FAB ionization 에서 sample droplet 은 8-10 keV 의 에너지를 갖은 atom(Ar, Xe) 과 충돌 충돌에서 액체상태의 시료가 gaseous ions 으로 상전환되는 sputtering-matrix 내에서 다단계 충돌에 의해 초기 고에너지 입자 로분터의 운동량의 재분배가 일어남 충돌의 생성물로 양이온 형성 모드에서 protonated molecular ions(M+H)+ 혹은 cationized species(M+Na)+ 형성 음이온 모드에서 (M-H)- 등 시료의 표면에서 발생됩니다.

Matrix 탈착 이온화가 일어나는 동안 분석물질과 혼합해서 사용하는 액 체 매트릭스는 FAB 에서 핵심적인 분야이다 일반적으로 시료는 Glycerol, 3-nitrobenzyl alcohol, triethanolamine 등이 사용된다 Matrix 의 기능 - freezing point 가 낮아서 시료가 고진공 상태의 ion source 로 유입될 때, 액체상태를 유지할 수 있도록 함. - 높은 에너지의 충격입자로 인하여 시료가 받는 damage 를 줄 여 줌

FAB 분석의 장단점 장점 : 작동이 빠르고 spectra 의 해석이 용이 단점 : 고농도의 유기용매 ( 예, 80-95% glycerol) 가 사 용되므로 sensitivity 에 한계가 있고, 어떤 경우 는 matrix solvent 에서 생성된 cluster ion 이 대부분의 spectrum 을 차지합니다.

Continuous flow FAB(CF-FAB) 기존 FAB 의 문제를 많이 해결 Matrix 와 시료를 probe tip 에 적용하는 대신, probe 가 연속적 으로 sample solution 을 일정 유속으로 target 에 공급 소량의 organic matrix 를 사용하게 되며, 더 낮은 chemical background 로 signal-to-noise ratio 를 증가시킬 수 있도록 함. CF-FAB 의 가장 큰 장점은 HPLC 혹은 capillary electrophoresis 의 연결에 유용

ESI (Electrospray Ionization) Electrospray 기술은 유용한 Mass range 를 분자량 50,000 이상 으로 확장시킨 이온화방법으로, 금세기 초 liquid 를 전기적으로 분 산시키는 기술에서 출발 sample solution 을 small tube 로부터 nitrogen 흐름 속의 강력한 전기 장으로 spray 해서 ion 을 발생 Spray 형성은 ES 의 핵심기술인데, 전기적인 오작동 및 operating 의 안정성을 위해서 solvent 는 모두 filtering 하여야 하며, 전해질 농도는 높지 않게 하여야한다 ESI 는 대부분의 mass 분석기와 연결해서 사용가능

Most Organic Compounds are not Suitable

MECHANISM OF ESI 시료가 SS Nedle 을 통해 ES chamber 에 들어옴 Capillary tip 으로부터 liquid 가 electro- static dispersion 되어서 droplet 이 spray 됨 bath gas(nitrogen) 에 의해 declustering 되 면서 solvent 분자를 소실하여 각각의 ion 형성

Electrospray ion 의 형성 Evaporation `+` + +

ESI source

SCHEMATIC OF ESI ION SOURCE

ESI spectra 를 이용한 MW 계산 ESI 이온화시 잔류용매에 있는 과량의 양성자에 의해 분석물질은 다가 이온으로 변할 수 있음 Assume a molecule of mw = 900 ESI spectrum yields ions that appear to carry 1, 2 & 3 charges M + H + MH M + 2H + (MH 2 ) M + 3H + (MH 3 ) mw = [(m/z)* charge state] – charge state mw 1 = (901*1) – 1 = 900 mw 2 = (451*2) – 2 = 900 mw 3 = (301*3) – 3 = 900

ESI 의 장점 거의 모든 시료에서 이온화가 가능 실제 분자량의 1/10, 1/30 에 해당하는 M/Z 값을 볼 수 있음 - 측정 가능한 분자량의 범위는 기기의 명목상 측정 범위 보다 큰 분자량을 측정할 수 있다. ESI 는 다중 전하물질을 생성하므로 다중의 m/z 값을 평가하 면 0.01% 의 정밀도로 실제 분자량을 계산할 수 있다. - 38,842 의 거대 분자를 ±4 의 정밀도로 분자량 측정이 가능

ESI 는 아주 좋은 감도로 분석이 이루어지기 때문에 20femtomol 정도의 시료로 단백질 측정이 가능하다 - 단백질 분자량 측정시 10,000 의 분자량을 가진 시료는 20g 정도면 분석이 가능

ESI 의 단점 모든 유기물화합물에 적용하기 어렵다 > ionic, polar spray 의 형성이 buffer, salt 농도에 민감하게 영향을 받음 Spectra can be influenced by solution and gas-phase chemistry occurring in the ES source

ESI 분석용 용매 Suitable Water Methanol Ethanol n-Propyl alcohol Isopropyl alcohol t-Butyl alcohol Acetonitrile Acetone Pyridine Tetrahydrofuran Aniline Nitromethane Acetic acid Chloroform Hexamethylphosphoretriamide N-Methylformamide Dimethylformamide Dimethyl sulfoxide Dichloromethane 1,2-Dichloroethane Tetrachloroethane Not suitable Benzene Toluene Ligroin Carbon tetrachloride Carbon disulfide Styrene Formamide Hexane Cyclohexane

APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) APCI 는 1973 년 Horning 에 의해 최초 개발되었음 이온화는 대기압하에서 질소기류 중에 LC 에서 용출한 액을 가열 하 여 기화 시켜 이온화를 발생 APCI 의 이온화방법으 원리적으로 CI 와 같음 - 시료 중의 용매가 CI 과정에서 반응기체의 역할을 함

APCI Mechanisms Vaporation ---> Solvent ionized ----> Charge transfer to analyte

APCI Source

LC/MS interface

When to use of APCI 시료에 산이나 염기성 물질이 없느 경우. 시료가 휘발될 수 있는경우. 유량, 용매 등의 조건이 electrospray 에 맞지 않는 경우. 시료가 electrospray 반응에 약할 경우 Ease of operation/ruggedness of API-MS method

ESI, APCI, CI 의 mass spectro

ESI 와 APCI 의 비교 Mobile phase : APCI 가 유량, 용매에 영향을 덜 받는다. Spectral information : 둘다 물질의 구조를 알 수 있지만, APCI 는 열분해 또는 고온 probe 에 의하며, ESI 는 비휘발성 물질에서 더 좋은 분석법이다. Sensitivity : APCI 는 휘발성이 있고 안정적인 물질 분석에 적합하며, ESI 는 ionic 또는 amine 류 분석에 적합하다.  Operating parameters : APCI - temperature, ESI - pH

Mass Analyzers 의 종류 Magnetic Sector Analyzer ; Single Focusing, Double Focusing Quadrupole Mass Analyzer Time of Flight Mass Analyzer

HRMS Analyser

최초의 Mass Spectrometer 는 20 세기 초에 J.J.Thomson 이 Ne 의 동위 원소 분석을 위해 사용 자기 섹터 질량분석기에서 모든 이온은 동일한 운동에너지 (KE) 로 가속 되며, 이때 KE=1/2(mv 2 ) 이므로 이온들의 질량이 다르면 운동속도가 달라짐 전하를 띤 입자들이 자기장 속에서 90 의 힘을 받으며 휘어진 경 로를 지나간다. 이 경로의 곡률은 전하를 띤 입자의 질량 × 속도에 비례 검출기에 도달하는 이온의 m/z 와 자기장과의 관계식은 m/z=R 2 H 2 /2V R= 곡률반경 ( 일정 ), H= 자기장의 세기, V= 가속전압 Magnetic Sector Analyzer

Mgnet sector type 의 질량분석기는 고정된 자석 반경 에서 최대 자기장의 세기, 최대 가속 전압을 제어함으 로써 가능한 한 최대범위의 m/z 값을 측정할 수 있다. 자기장이 일정할 때 가속전압을 감소 시키면 검출되는 m/z 값의 범위가 증가 하지만 통과하는 이온수가 적어 져 검출한계가 감소하게 된다. - 최대로 줄일 수 있는 가속전압은 최대 50% 정도 Sector type 의 질량분석기는 0.1m/z 질량차이를 측정 할 수 있다.

Single-focusing magnetic-sector MS

Double focusing type

Double focusing = Magnetic sector + Electric sector 이온이 가속되는 과정에서 같은 질량이지만 서로 다른 운동에너지를 갖는 입자가 발생하면 focusing 에 문제가 발생 -Focusing 의 향상 ( resolution 의 향상 ) 을 위해 electric analyzer 를 magnet sector 의 앞부분에 장치 동일한 운동에너지를 갖는 입자를 집속시켜 자기장 으로 보냄 - 질량차가 미세한 입자들을 분리

Electric sector 는 두개의 전장으로 구성되어 있으며, + 이온 분석 시 외부는 + 전위, 내부는 – 전위가 작동 함. Electric srctor 는 동일한 에너지를 갖는 이온을 선택하기 위하여 사용 - 초기 이온은 0-3eV 의 운동에너지를 가지며 분석관으로 향함. - 3,000V 로 가속된다면 운동에너지는 2,997eV 에서 3,003eV 의 값을 가짐 - 이중 초점 질량분석관에서 Electric secto 는 3,000± ‘ 3 eV 를 갖는 이온만이 검출됨.

High resolution Resolution (Rs = m/Δm) Low Rs 100 < Rs <1000 Δm = 1 ( unit Rs ) Medium Rs 2000 < Rs < < Δm < 1 High Rs < Rs Δm < 0.01 H h M1M1 M2M2 h / H ⅹ 100 = 10% Rs = M / Δm = M 1 / (M 2 -M 1 ) (m/z) % 40 ㎜ 10 ㎜ Rs = M / Δm = 300/(1 ⅹ (10/40)) = 1200

C 5 H 8 O 와 C 6 H 12 의 분석 두 시료모두 m/z 는 84 로 동일 유기 질량분석법에서 자연계에서 존재하는 일반적인 원소의 질 질량은 H C O F Cl C 5 H 8 O= , C 6 H 12 = 으로 36.3mmu 의 차이가있음 동시에 존재하는 두 물질을 분리하려면 최소 9,000 이상의 분해능 이 필요 물질의 최종 분자식 확인 시 시료를 R=10,000 에서 분석하여 error 가 1ppm 이내가 되어야 함.