분자 생물학 5장. 핵산 취급 기술

핵산 취급 시 주의사항 Activity 유지 (DNA 손상 방지). Purifying DNA (단백질 제거). Nuclease contamination 방지. Flexible 하므로 조심스럽게 취급. 유리기구 사용금지 (DNA가 유리 벽에 부착). Polyethylene tube 사용.

Bacteriophage DNA Isolation Phage 현탁액에 PEG(Poly Ethylene Glycol) 처리. 원심분리 후 pellet(phage particle)에 TE buffer add. Phenol add. 원심분리 후 phenol 제거(TE buffer 내에 DNA 존재). EtOH(Ethyl alcohol) 2배 첨가. 원심분리 : DNA ppt(침전물) 획득. (EtOH ppt법 : 에탄올 침전 법).

Bacterial DNA Isolation 원심분리 후 pellet에 TE buffer add. Cell wall lysis. G(+) Bacteria : Lysozyme. G(-) Bacteria : SDS, Triton x-100. Phenol 처리(단백질 제거). RNase 처리(RNA 제거). EtOH 2 배 add. 원심분리 : DNA ppt(에탄올 침전 법). ※ Yeast와 Fungus: Bacteria와 동일(세포벽 분해: chitinase).

Eucaryote (진 핵 생물)의 DNA 분리 Animal cell, Plant cell 원심분리(밀도 기울기). 핵 분리(미토콘드리아, 엽록체 제거). 핵막 Lysis(SDS 또는 Triton x-100). RNase 처리(RNA 제거). Pronase처리(단백질 제거). EtoH 2 vol. 첨가(에탄올 침전). ※ RNA 분리 : DNA 분리 방법과 동일(DNase 처리). ※ 단백질 제거 : Protease, chloroform, pronase, phenol 처리 후, 원심분리 하여 proteine 제거.

핵산의 방사선 동위 원소 표지 법 배양학적 방법(배지에 전구물질 첨가). DNA 표지. 증식배지에 [3H] Thymidine, [14C]Thymidine 첨가. 새로 복제된 DNA의 thymine:3H 또는 14C로 표지 됨. ※많은 방사능 량이 필요할 때 : 32P로 표지 함. RNA의 PO3 표지 되므로 RNase 또는 묽은 Alkali 처리: RNA 분해.

핵산의 방사선 동위 원소 표지 법 RNA 표지. 증식배지에 [3H]uridine, [14C]uridine 첨가. Uridine Triphosphate(UTP) 합성. RNA로 중합. ※ DNA, RNA 모두 표지 되므로 DNase처리. ※ dUMP의 methy 화 : dTMP로 전환(DNA로 전환).

핵산의 방사선 동위 원소 표지 법(효소학적 방법)

Restriction Endonuclease(제한효소) DNA 분자 내의 특정 염기서열 인식함. 각 가닥의 한 장소를 절단 : 3’-OH와 5’-P 말단 형성. 일부는 회문 구조(Palindrome structure) 인식. Ⅰtype, Ⅱtype 효소.

Flush end : Blunt end 평활 말단, 평 편 말단, 단면 말단. 대칭축의 중심 축을 절단 : Sma I , Bal I.

Cohesive end : Sticky end 점착성 말단(Bam H1, Eco R1). 대칭축의 일정 염기만큼 떨어진 곳을 절단.

제한효소의 절단 부위

Agarose gel electrophoresis

Restriction Map : 제한효소 지도

Double digestion : 이중 절단

Plasmid DNA 란? Extrachromosomal DNA. CCC-form DNA. (Covalently Closed Circle form). Double strand DNA(ds DNA). Replicon. Gene marker. F, R, Col, Tol, 2 um, Ti.

Plasmid isolation Bacteria Bacterial Lysate(cell lysate) Clear Lysate Lysozyme, EDTA ,SDS, Triton X-100 Bacterial Lysate(cell lysate) 원심분리(단백질, RNA, 염색체 DNA 제거) Clear Lysate EtBr-CsCl 평형 밀도기울기 원심분리. Low band isolation n – butannol처리(EtBr제거) Purifyed plasmid DNA (Agarose gel electrophoresis) Ether 처리(n – butanol제거) EtoH 2vol add(에탄올 침전법) Dialysis(CsCl 제거)

Plasmid를 이용한 제한효소 단편의 cloning

DNA 상보가닥의 분리 전기영동 : DNA 변성 후 Agarose gel electrophoresis 두 가닥으로 분리됨 : mechanism 미 규명. Ribopolymer 방법: DNA 변성(Alkali 방법 또는 Heating 방법). 변성된 DNA에 Polyribopurine add(Inosine,Guanine: Poly I,G) Ribopolymer가 DNA 가닥 내 C, T와 결합. Ribopolymer의 결합량에 따라 밀도 차이가 생김. CsCl 평형 밀도기울기 원심분리 : 두 가닥 분리. RNase 와 Alkali 처리(Ribopolymer 제거).

Ribopolymer 방법

Blotting에 의한 혼성화 Filter binding technique(필터 결합 기술). Southern transfer procedure(서던 전이 방법). DNA-DNA hybridizatio (ss DNA prove 사용). Northern blotting. DNA-RNA hybridization(RNA prove, ss DNA prove) Western blotting. DNA –protein hybridization(ds DNA prove 로 사용). 단백질을 전기영동 한 후, DNA를 찾아냄.

DNA Transfer

Southern (서어던) 전이 기술

Southern Blotting

Hybridization Procedure DNA + 제한효소 처리 Agarose gel electrophoresis DNA fragnent NaOH 처리(변성) Nitrocellulose filter로 transfer 32P로 표지 된 prove sol. 에 침지 (변성 DNA 또는 RNA 찾는데 사용) 잘 봉합된 Plastic 안에서 재생 (건조방지,16~24시간,0.15~0.5 M, Tm보다 20~25℃낮게) Washing (결합되지 않는 것 제거) X-선 film (Autoradio graphy)<검게 감광됨>

cDNA(Complemantary DNA) 제조

Maxam-Gilbert procedure : 화학적 방법 Double strand DNA 제한효소 처리(한 종류 또는 그 이상) 짧은 DNA fragment 32P로 label 변성(90℃, DMSO) HO-3’ 5’-P32(전기영동: 두 가닥 분지) ⅠSol. ⅡSol. Dimethy sulfate처리 Purin염기 methy 화(G가 A의 5배로 메칠화) ⅡA Sol. ⅡB Sol. 묽은 완충액 내에서 hydrazine처리 Hydragen 처리 ⅠA Sol. ⅠB Sol.

Maxam-Gilbert procedure : 화학적 방법 2M Nacl에서 C에만 반응 Heating No heating 묽은 산 처리 C+T에 작용 메칠화된 염기제거 (Deoxyribose만 남음) 메칠화된 A제거 (약간의 G 포함) Piperidin 처리 당-인산 결합 절단 (C절편) 당-인산 결합 절단 (C+T절편) 알카리 처리 알카리 처리 당•인산 결합 끊어짐 (G단편) 당•인산 결합 끊어짐 (A+G단편)

A+G와 C+T 단편

염기서열 규명 : 전기영동 20% Polyacrylamid gel electrophoresis. 8M Urea buffer 사용 (수소 결합방지).

염기서열 규명 : 전기영동