Amplification and purification of BDNF-/NGF-adeno virus
Transfect 293cells with BDNF-/NGF-adeno virus Harvesting infected 293cells Purification & dialysis of adeno virus Titration of adeno virus Store at -70°C
Transfect 293cells with BDNF-/NGF-adeno virus DNA를 culture 중인 cell 내로 유입시켜 외부 DNA가 세포 내에서 발현되도록 하는 것이 transfection의 목적이다. DNA는 negative charge를 띄는 분자이고 cell membrane 또한 negative charge를 띈다. 따라서 DNA를 cell 속으로, 더구나 핵 속으로 까지 유입 시키는 것은 까다로운 일이며, 높은 tranfection efficiency를 얻는 것이 모든 실험의 관건이다. DNA를 cell 내로 유입 시키는 방법은 크게 chemical method : calcium-phosphate, Lipofectin등의 cationic liposome 등이 DNA를 packaging하는 agent 로 사용 physical method : electroporation, gene gun virus mediated method : adenovirus나 retrovirus의 virus genome에 원하는 DNA를 cloning 삽입하여 세포에 감염시키는 방법 (BDNF-, NGF-adenovirus) <BDNF adenovirus>
Transfect 293cells with BDNF-/NGF-adeno virus * Materials 1.100mm dish에 배양한 293 cell 2.DMEM(10% FBS, antibiotics 함유) 3.Phosphate Buffered Saline 4.Serum free medium (serum과 antibiotics가 첨가되지 않은 DMEM) 5.6 well plate 6.purified adenovirus * Methods 1.100mm Culture dish에 293 cell 을 배양한다. 2.293cell 이 50-80% confluency 에 도달하면 infection을 시작한다. 3.배지를 제거하고, PBS로 washing 한다. 4.0.05% Trypsin EDTA를 넣어 배양용기로부터 세포를 떼어낸 후, 800 rpm에서 5분간 원심분리한다. 5.cell counting을 한 후, 필요한 virus 양을 계산한다. 6.Serum free DMEM 을 2ml 을 넣어준다. 7.필요한 양의 Purified virus를 넣어준 후 37 ℃ 세포배양기에 넣는다. 8.4시간에서 6시간 후에 10% FBS DMEM을 넣어주고 배양한다.