2018.03.11 SNUBH 내과 연수강좌 자가항체 양성, 자가면역질환인가요? 강은하 분당서울대학교병원 류마티스내과

Contents Rheumatoid factor (RF) Anti-cyclic citrullinated peptide antibody (anti-CCP) Anti-nuclear antibody (ANA)

Question 자가면역 질환: 질환 관련 자가항체 또는 질환 특이 자가 항체가 출현하는 것을 특징으로 한다. 그렇다면 자가항체 출현으로 자가면역 질환을 진단할 수 있을까?

Rheumatoid factor (RF) Auto-antibody against Fc portion of IgG Present in most people at very low levels Seen in 5~6% of the elderly in the normal population Induced by immune complex formation (immunization, infection…) Not specific for RA (rheumatoid arthritis) RF는 면역글로불린 IgG의 Fc portion에 결합하는 특이도를 가진 자가항체로, 실제 IgG, IgM, IgA 모두 존재하나 검사실에서는 IgM RF만 측정하지만 (하지만 peripheral circulation 에서 RF 의 주로 immunoglobulin class는 IgM과 IgA로 알려져 있다, 여러 방법으로 측정했지만 최근에는 EISA나 nephelometric assay를 가장 많이 사용한다.) 이는 대부분의 인구에서 매우 낮은 level로 존재하며, 하지만 나이가 들면서 그 농도가 증가하여 양성률이 증가하여 정상 elderly 의 5-6% 정도에서 RF 가 양성을 보임이 보고되어 있습니다. RF는 류마티스 관절염에 특이적인 검사가 아니어서 다른 여러 질환에서 양성으로 나올 수 있습니다.

RF In Korean population HBs Ag (+) : 13~18% RF (+) Anti-HCV (+) : 6~13% RF (+) 이 표에서 보시는 바와 같이 류마티스 관절염에서는 60-80%의 환자에서 RF (+)소견을 보이지만 그 외에 쇼그렌 증후군, 전신홍반 루푸스와 같은 결체 조직 질환에서도 양성률이 꽤 높습니다. 실제 우리 나라 보고에서 HBs Ag (+) 인 사람에서 RF 양성률은 13~18%, anti-HCV (+) 인 사람에서 RF 양성률은 6~13% 정도로 보고되어 있습니다. Curr Opin Rheumatol 2004;16:246-53

Anti-citrullinated peptide antibody (ACPA) 질환의 기시 = 만성 환경적 인자 (smoking, air pollutant etc..) 5. 표적 장기에서의 ACPA생성 2. 폐 내 단백의 citrullination에 따른 단백 항원성 향상 환경적 인자에 의해 만성 염증이 유발되면 citrullination에 관여하는 enzyme이 발현 4.2. 관절 손상 폐와 관절에서 생성된 ACPA의 항원이 유사하므로 폐내 유발된 ACPAs는 관절 손상에도 관여할 것으로 생각된다. 2000년대 들어 류마티스 관절염에서 항 시트룰린 항체 ( nti-citrullinated peptide antibody, 줄여서 ACPA라고도 부르는데요) 검사가 개발되면서 진단에 도움이 되고 있습니다. Citrulline은 일종의 아미노산으로, arginine peptide가 PAD (peptidylarginine deiminase)라는 효소에 의해 탈이민화 (NH2기가 O기로 치환)되면서 나타나는 post-translational modification 을 citrullination 이라고 합니다. 특정 단백질이 어떠한 환경적 요인에 의해 citrullination 되면서 단백질의 구조와 antigenicity, function 이 변하게 됩니다. 이 citrulline이 포함된 peptide가 자가항원으로 작용할 수 있고 실제 류마티스 관절염 환자의 활막 조직에서 citrullinated protein이 많이 존재하는 것이 밝혀지면서 anti-citrullinated peptide antibody 를 검출하고자 노력하였고 3. Citrullination된 폐 내 단백에 대한 ACPA의 생성 특정 HLA (=SE)에 항원 제시된 citrullinated peptide에 대한 면역 반응으로 anti-citrullinated protein antibody인 ACPA가 생성된다. B cell T cell APC signals or cytokines RA specific!!

RA autoantibody kinetics before disease onset 류마티스 인자의 임상적인 의미에 대하여 말씀드리면 역학 조사에서는 류마티스 관절염이 발병하기 몇 년 전부터 환자의 혈청에서 RF가 양성으로 나옴이 보고되어 있습니다. 앞에 말씀드린 대로 RF 자체가 특이도가 높은 검사는 아니지만 RF titer가 높을 수록 류마티스 관절염 진단에 대한 특이도가 높아지며, 재발성 류마티즘이나 미분화성 관절염 환자에서 류마티스 관절염으로의 진행 확률이 높은 것으로 보고되어 있습니다. 또한 류마티스 관절염으로 진단받은 환자에서 RF titer가 높은 경우는 질병이 더 aggressive 하고 관절 손상이 더 심하고 ILD와 vasculitis와 같은 extraarticular manifestion 과의 연관성이 높은 것으로 보고되어 있습니다. 또한 류마티스 관절염 치료제인 rituximab의 경우 RF (+)인 환자에서 더 치료 반응이 좋을 것을 예측해 볼 수 있습니다. 하지만 류마티스 인자는 민감도와 특이도가 높지 않고, 특히 정상인과, 다른 만성질환에서도 양성으로 나오는 등 류마티스 관절염의 진단에 비특이적이어서 해석에 어려움이 많았습니다. They are found in 75 to 80 percent of rheumatoid arthritis (RA) patients at some time during the course of their disease. High titer IgM RF is relatively specific for the diagnosis of RA in the context of a chronic polyarthritis and was, for decades, the sole serologic criterion widely used in the diagnosis of RA. However, it has little predictive value in the general population, because the overall disease prevalence is relatively low Arthritis Rheum 2003, 2004

Diagnostic performance of ACPA and RF Meta-analysis in clinical RA (those with clinical synovitis) Similar sensitivity, but higher specificity of ACPA for RA diagnosis Found in 40% of patients who are RF negative Predictive of progressive joint destruction Precede before the onset of RA = diagnostic performance during preclinical phase is unknown. Sensitivity Specificity Positive LR Negative LR RF 70 (66-73)% 79 (74-83)% 3.3 (2.7-3.9) 0.39 (0.35-0.42) Anti-CCP 67 (64-70)% 95 (94-96)% 14.4 (11.6-18.0) 0.35 (0.32-0.38) Ann Intern Med 2010;152:456-64 이러한 시트룰린화 펩타이드에 대한 자가항체 중 상업적으로 검사하기 용이하고 만족할 만한 수준의 민감도 및 특이도로 검출하기 위해 인공적으로 만든 환형의 (cyclic) 분자구조를 가진 시트룰린기가 있는 펩타이드에 대한 항체, 항-CCP항체가 개발되어서 널리 쓰이고 있습니다. 최근 나온 메타 분석을 보시면 류마티스 인자와 비교하여 항-CCP항체의 민감도는 70% 정도로 유사하나 특이도는 95% 정도로 높아 류마티스 관절염 진단에 유용합니다. 또한 RA (-) 환자의 40% 정도에서 양성으로 나와 RA 진단에 더 유용하게 쓰일 수 있고. Anti-CCP 양성인 경우 향후 관절 손상이 더 심할 것을 예측할 수 있습니다. 또한 류마티스 인자와 마찬가지로 질병의 발병 몇 년 전부터 혈청에서 양성으로 나올 수 있는데 초기 미분화성 관절염에서 항-CCP 항체가 양성인 경우 류마티스 관절염으로 진행하는데 특이도가 매우 높았으며, 정상 대조군 코호트 연구에서도 류마티스 관절염이 발생하기 이전부터 이미 혈청 내에서 존재한다는 것이 입증되었습니다.

Clinical significance of RF/ACPA in clinical RA Precede several years before the onset of RA High-titer of RF/ACPA Specificity for RA↑ particularly in case of RF Predict progression to RA High titer RF/ACPA(+) in patients with RA More aggressive and erosive diseases ↑Clinically significant response to rituximab Strong correlation with extra-articular manifestations (ILD, vasculitis) when high titer RF(+) 류마티스 인자의 임상적인 의미에 대하여 말씀드리면 역학 조사에서는 류마티스 관절염이 발병하기 몇 년 전부터 환자의 혈청에서 RF가 양성으로 나옴이 보고되어 있습니다. 앞에 말씀드린 대로 RF 자체가 특이도가 높은 검사는 아니지만 RF titer가 높을 수록 류마티스 관절염 진단에 대한 특이도가 높아지며, 재발성 류마티즘이나 미분화성 관절염 환자에서 류마티스 관절염으로의 진행 확률이 높은 것으로 보고되어 있습니다. 또한 류마티스 관절염으로 진단받은 환자에서 RF titer가 높은 경우는 질병이 더 aggressive 하고 관절 손상이 더 심하고 ILD와 vasculitis와 같은 extraarticular manifestion 과의 연관성이 높은 것으로 보고되어 있습니다. 또한 류마티스 관절염 치료제인 rituximab의 경우 RF (+)인 환자에서 더 치료 반응이 좋을 것을 예측해 볼 수 있습니다. 하지만 류마티스 인자는 민감도와 특이도가 높지 않고, 특히 정상인과, 다른 만성질환에서도 양성으로 나오는 등 류마티스 관절염의 진단에 비특이적이어서 해석에 어려움이 많았습니다. They are found in 75 to 80 percent of rheumatoid arthritis (RA) patients at some time during the course of their disease. High titer IgM RF is relatively specific for the diagnosis of RA in the context of a chronic polyarthritis and was, for decades, the sole serologic criterion widely used in the diagnosis of RA. However, it has little predictive value in the general population, because the overall disease prevalence is relatively low Ann Intern Med 2010;152:456-64

RA autoantibody (RF, ACPA) RF = RA non-specific ACPA = RA specific, high positive predictive value 질환이 발현하기 (수개월~수년) 전 부터 출현 질환 발현 근접에 가까워 질 수록, 항체 양성율의 증가 질환 발현 근접에 가까워 질 수록, 항체 titer의 증가

RF & anti-CCP for the diagnosis of clinical RA RA less likely; observed in 20-30% of RA Non-RA diseases, infection, RA Early RA vs. Transient elevation Consistent with RA; predictive of progressive joint destruction Likelihood of RA

RF & anti-CCP for the diagnosis of clinical RA Likelihood of RA Symptom duration Acute phase reactants Joint examination The squeeze test is a method of identifying subtle inflammation in the absence of obvious swelling or tenderness of individual MCP or MTP joints. If the squeeze causes undue pain it raises the possibility of underlying joint inflammation. MCP squeezing test MTP squeezing test

2010 ACR/EULAR classification criteria for RA Definitively diagnosed with RA if summated score ≥6 points. Domains Points Definitions Joint involvement 1 medium-large joint 1 2-10 medium-large joints 2 1-3 small joints 3 4-10 small joints 5 More than 10 small joints Serology Both RF and anti-CCP, negative Either RF or anti-CCP, positive ≤ 3 times of UNL Either RF or anti-CCP, positive > 3 times of UNL Duration of synovitis < 6 weeks ≥ 6 weeks Acute phase reactant Normal ESR and CRP Abnormal ESR and CRP 이에 2010년 류마티스 관절염의 조기 발견 및 치료를 위해 미국/유럽 류마티스 학회에서 류마티스 관절염 분류 기준을 새롭게 제정하였고 그 기준에서 류마티스 인자와 항-CCP 항체가 중요한 항목으로 포함되었습니다. 새로운 분류 기준에서는 환자의 관절 침범, RF와 ACPA의 양성 여부와 그 농도 ESR/CRP의 상승 여부, 증상의 이환 기간이 포함되어 있습니다. 특이 양성이어도 titer가 높을 수록 더 확률이 높기 때문에 Low positive 와 high positive 로 나누어 놓았고 이 high positive 의 기준은 각 검사실의 upper normal limit의 3배라고 생각하시면 됩니다.

증례 1 50세 여자 환자, 건강검진에서 RF (+) 혈액 검사 소견 RF (+) : 30 IU/mL (normal range: -20) ESR 21 mm/hr, CRP 0.15 mg/dL HBsAg (-), anti-HBs (+), anti-HCV (+) 그 전의 검진 결과 작년 RF (+) = 35 IU/mL 재작년 RF (+) = 28 IU/mL ESR/CRP = normal 자세한 문진 및 관절 진찰, X-ray 소견 종합 관절 진찰상 4군데 MCP/PIP swelling 및 tenderness, X-ray상 normal: early 또는 imminent RA 강력히 의심, anti-CCP 확인 후 short-term FU 관절 진찰상 joint swelling 없음, DIP tenderness+, X-ray 상 DIP joint의 joint space narrowing 및 osteophyte 관찰 : OA, RF false (+) d/t HCV 관절 진찰상 PIP joint swelling-, tenderness+, 문진상 dry mouth 및 dry eye (+), X-ray 소견 정상 : FANA, anti-Ro/La 검사 및 Sjogren’s syndrome에 대한 검사 고려

증례 2 50세 여자 환자, 건강검진에서 anti-CCP (+) 혈액 검사 소견 Anti-CCP (+) : 27 IU/mL (normal range: -15) ESR 10 mm/hr, CRP 0.05 mg/dL NO joint pain NO clinical synovitis (no swelling or tenderness) Preclinical RA vs. transient ACPA elevation Re-examine in 3-6 months: titer rise vs. negative conversion

Preclinical RA vs. RF(+) of other causes 증례 3 45세 여자 환자, 건강검진에서 RF (+) 혈액 검사 소견 RF (+) : 95 IU/mL (normal range: -20) ESR 21 mm/hr, CRP 0.15 mg/dL NO joint symptom HBsAg (-), anti-HBs (-), anti-HCV (-) 그 전의 검진 결과 작년 RF (+) = 35 IU/mL 재작년 RF (+) = 67 IU/mL ESR/CRP = normal Preclinical RA vs. RF(+) of other causes Check ACPA Examine sicca or other mucocutaneous/vascular/muscular sx Other recent infection, vaccination FU periodically

증례 4 64세 여자 환자, 건강검진에서 anti-CCP (+) 혈액 검사 소견 Anti-CCP (+) >= 200 IU/mL (normal range: -15) ESR 25 mm/hr, CRP 0.5 mg/dL NO joint pain NO clinical synovitis (no swelling or tenderness) Preclinical RA (impending RA) Short-term FU q1month or early visit as soon as joint symptom develops

Positive anti-CCP in other diseases Positivity (%) Rheumatic diseases SLE 13-17 Associated with deforming or erosive arthritis Primary Sjogren’s syndrome 10 Psoriatic arthritis 12 Palindromic rheumatism 39 Associated with progression into RA Juvenile idiopathic arthritis 24 Behcet’s disease 4 Associated with joint involvement Chronic infectious diseases Active tuberculosis 7-39 AIDS 15 Decrease with anti-retroviral therapy Hepatitis C virus Rarely present, but 33.3% in HCV related arthritis Other diseases Alpha1-antitrypsin deficiency 3 COPD 5 Lung disease without RA Healthy population 1 항-CCP 항체가 RF 보다 특이도가 훨씬 높긴 하지만 다른 질환과 컨디션에서도 양성이 나올 수 있음이 표와 같이 보고되어 있어 이 역시 혈액 검사만으로 진단적이지는 않습니다. 조금 특이할 만한 점은 RF 와 달리 anti-CCP는 hepatitic C 환자에서 거의 존재하지 않으나, HCV related arthritis 환자의 1/3 정도에서는 양성이라 보고되어 있고 SLE나 behcet같은 결체 조직 질환에서 항-CCP항체 양성은 관절의 침범 및 손상과 연관이 있다고 보고되어 있습니다. J Autoimmun 2014;48-49:26-30

Antinuclear antibody (ANA, FANA) Diverse group of autoantibodies directed against antigens in the nucleus Detected by immunofluorescence No information on specific Ag Titer is determined by serum dilution 다음으로 말씀드릴 검사 항목은 antinuclear antibody, 줄여서 ANA 또는 FANA라고도 많이 불리는 항핵 항체에 대해 말씀드리겠습니다. 실제 전신적인 염증 증상을 동반하는 류마티스 질환들 – 대표적으로 전신 홍반 루푸스, 쇼그렌 증후군 환자에서 관절통이나 관절염이 동반되는 경우가 많습니다. 또한 원인이 뚜렷치 않은 발열, 피부 염증, 신장염 등이 있을 때 보통 항핵 항체 검사를 많이 하게 됩니다. 항핵 항체는 우리 몸의 세포를 구성하는 여러 가지 핵항원에 대한 자가항체를 이야기합니다. 특히 전신홍반 루푸스의 선별검사로 유용하게 사용됩니다만 그 밖의 다양한 자가면역질환에서 양성으로 나올 수 있습니다.

Indirect immuno-fluorescence technique Y Y Y Microscope slide with HEp2 cells Patient’s serum Fluorescently labeled goat anti-human IgG 항핵 항체 검사를 이해하려면 간단한 검사방법을 이해하여야 하는데 ANA는 indirect IF technique으로 검사하게 됩니다. 검사 방법을 간단히 설명드리면 Hep2 cell을 부착해 놓은 slide에 환자의 혈청을 반응시키고 환자 혈청에 이 cell에 대한 자가항체가 존재하면 반응하여 붙고, 2차적으로 human Ig에 대한 형광을 표지한 2ndary ab를 반응시켜 형광현미경에서 발색반응이 있는 지를 관찰하게 됩니다 일반적으로 환자 혈청을 1:40 으로 희석하여 screening 검사를 진행하고 여기에서 핵과 그 주변으로 형광 염색되면 ANA (+)으로 보고하게 되고 양성인 환자에서 계속적으로 희석하여 검사 반복후 titer를 보고하게 됩니다. 이런 과정으로 검사하게 되어 발생하는 단점은 검사 결과가 observer-dependent하여 검사자에 따라 형광 염색을 인식하는 민감도가 달라질 수 있고 이 검사는 정확한 자가항체의 항원을 발견할 수는 없습니다. Interpretation of fluorescent ANA staining is observer dependent Unable to determine the precise antigen recognized by the patient’s serum 1:40 serum dilution 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 Titer=1:320

Significance of ANA titer ANA in normal people If ANA ≥ 1:160 = optimal balance between sensitivity and specificity SLE : specificity 20%, sensitivity 95%, PPV: 11~13% Positive ANA assay is considerably less useful for making diagnosis Titer Prevalence (%) ≥1:40 20-30 ≥1:80 10-12 ≥1:160 5 ≥1:320 3 FANA positivity in USA 항핵항체의 경우 그 해석에 있어 ANA titer가 중요한데, 건강한 사람에서 많게는 30% 정도까지 1:40 양성으로 나올 수 있고 1:320 양성도 3% 정도 된다고 보고되어 있습니다. 또한 표에서 보시듯이 여성에서 양성률이 더 높으면 나이가 들수록 양성률이 높아집니다. 그러면 어느 정도의 titer를 자가면역 질환을 시사하는 기준으로 볼 것인지…. 그 기준 titer를 높이면 sensitivity 는 감소하고 titer가 낮추면 specificity 가 떨어지게 될 텐데요. 일반적으로는 향핵항체의 역가가 1:160 이상을 민감도와 특이도가 적절한 정도로 이야기하고 있으며 이런 경우 자가면역질환 발병의 가능성이 높아지므로 주의 깊게 살펴 볼 필요가 있겠습니다 실제 SLE를 놓고 봤을 때 ANA 1:160 양성을 기준으로 진단에 대한 특이도는 20%, 민감도는 95%, 양성 예측률은 11-13%로 보고되어 있습니다. 이런 수치들을 봤을 때 ANA는 screening에는 도움이 되겠지만 진단하는 데에는 많이 부족합니다. Arthritis Rheum 2012;64:2319-27 Arch Pathol Lab Med 2000;124:71-81

FANA positive conditions Arch Pathol Lab Med 2000;124:71-81 FANA positive conditions Frequency of positive ANA (%) Very useful for diagnosis SLE 95-100 Systemic sclerosis (scleroderma) 60-80 Somewhat useful for diagnosis Sjogren’s syndrome 40-70 Idiopathic inflammatory myositis (DM/PM) 30-80 Useful for prognosis Juvenile chronic oligoarticular arthritis with uveitis 20-50 Raynaud phenomenon 20-60 Not useful in diagnosis RA 30-50 Multiple sclerosis 25 Idiopathic thrombocytopenic purpura 10-30 Thyroid disease Discoid lupus 5-25 Infectious diseases Varies widely Malignancies Patients with silicone breast implants 15-25 Fibromyalgia Relatives of patients with autoimmune disease

ANA pattern and autoimmune disease Anti-nuclear antibody (ANA) - seen in 98% of SLE - seen in other inflammatory, infectious, and neoplastic diseases - seen in 5% to 15% of normal persons - sensitive but not specific for SLE Rim/ peripheral Diffuse/ homogenous Speckled Centromere Nucleolar Staining pattern Autoantigens dsDNA Chromatin Histone nuclear RNPs (Sm, Ro/La, U1RNP) CENP-A to F Topoisomerase, RNA polymerase I, Various others Associated Disease SLE Drug-induced lupus SS Neonatal lupus MCTD SSc

Autoantibodies in SLE: ANA and others

ANA & autoantibody positivity 이전 류마티스 관절염에서 RF, anti-CCP 와 마찬가지로 전신홍반 루푸스의 경우에 질환의 발병 몇 년 전부터 혈청 내에서 ANA와 자가면역항체가 발견된다는 보고가 있습니다. 따라서 이런 자가항체가 양성이고 의심 증상이 있는 환자에서는 주의 깊게 관찰이 필요할 텐데.. 반대로 ANA 고농도 양성인 환자에서 무조건 자가면역 질환이 발생하지는 않습니다. 실제 한 연구에서 ANA 1:640 양성이 환자를 5년간 추적 관찰하였을 때 90%에서는 별다른 질환이 생기지 않았고 약 5% 씩 결체 조직 질환과 갑상선 질환이 발생함을 보고하였습니다. Precede before SLE diagnosis 5-year follow-up of ANA (+) pts (53 patients with ANA ≥1:640) N=47 : no disease N=3 : hypothyroidism N=3 : connective tissue disease N Eng J Med 2000;124:71-81 J Rheumatol 2003;30:736-9

Algorithm for the use of ANA in the diagnosis of CTD Algorithm for the use of antinuclear antibodies in the diagnosis of connective tissue disorders. See text for details. ANA, antinuclear antibody; FANA, fluorescent antinuclear antibody; MCTD, mixed connective tissue disease; SLE, systemic lupus erythematosus.

Diagnostic approach of rheumatic diseases 류마티스 질환 의심 증상 (관절통, 피부 발진, 근육통 등) Inflammatory vs non-inflammatory Articular vs non-articular Joint involvement Mono / Oligo / Polyarticular Symmetricity Involved sites History taking & Physical examination Imaging Synovial fluid Pathology Blood test RF, anti-CCP ANA, anti-ENA HLA-B27 Uric acid ESR, CRP

Summary 류마티스 질환 관련 혈액 검사는 그 자체로 진단적이지 않음 각 검사의 민감도, 특이도는 clinical phase를 기준으로 산출됨을 이해하고, preclinical phase에서 항체 양성의 의미를 고찰 연관 질환들의 임상 양상과 분류 기준을 숙지: 의심 증상이 있을 때 검사를 시행하는 것이 적절함 혈액 검사 소견만으로 류마티스 질환을 진단해서는 안 되며, 자세한 병력과 문진, 신체 진찰, 영상 소견 등을 종합하여 해석하여야 함

경청해 주셔서 감사합니다.